Materiály a metody
Příprava duplexní DNA. Pro přípravu 30-bp duplexních molekul DNA byly hybridizovány dva oligonukleotidy s následující sekvencí a modifikacemi (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Oligonukleotid 5′-GGGTATGGAGATTTTTAGCGGAGTGACAGC-3′ byl označen Cy5 na svém 5′ konci a Cy3 na svém 3′ konci. Komplementární oligonukleotid byl na obou koncích označen biotinem.
Exprese a purifikace proteinu. Gen žlutého fluorescenčního proteinu (YFP) v plazmidu p2Bac/pFastBac-YFP-M5-CaM (dar H. Lee Sweeneyho, University of Pennsylvania, Philadelphia) byl odstraněn pomocí PCR. Výsledný plazmid p2Bac/pFastBac-M5-CaM kóduje kuřecí myosin V, který je zkrácený na Glu-1099. Za nativní vinutou spirálou následuje leucinový zip, který zajišťuje dimerizaci. Pro usnadnění purifikace byl protein myosin V N-terminálně označen značkou FLAG (DYKDDDDK). Pro expresi proteinu v buňkách Sf9 byly vytvořeny dva rekombinantní bakuloviry. Jeden kódoval zkrácený myosin V a kalmodulin Drosophila melanogaster odvozený z plazmidu p2Bac/pFastBac-M5-CaM. Druhý virus kódoval lidský esenciální lehký řetězec odvozený z plazmidu p2Bac/pFastBac-ELC. Oba viry byly použity ke koinfekci buněk Sf9. Protein byl exprimován a purifikován podle popisu Sweeneyho et al. (20).
Značení a výměna kalmodulinu. Kalmodulin byl exprimován a značen pomocí Cy3 nebo Cy5 následujícím způsobem: Do kalmodulinu mořského ježka byl vnesen jeden cystein pomocí mutace Q143C. Tento kalmodulin byl exprimován v Escherichia coli a purifikován podle popisu v cit.21. Kalmodulin byl značen zásobními roztoky Cy3-maleimidu nebo Cy5-maleimidu (Amersham Biosciences) (v DMSO) v 1,4násobném molárním poměru po dobu 20 min. Přebytečné barvivo bylo odstraněno filtrací gelu do výměnného pufru (níže), po níž následovala noční hydrofobní absorpce na BioBeads (Bio-Rad). Inkorporace značky byla 102 % pro Cy3-kalmodulin a 75 % pro Cy5-kalmodulin. Alikvoty byly uchovávány při -80 °C.
Výměna značeného kalmodulinu na myosin V byla provedena, jak bylo popsáno, ale s některými modifikacemi (22). Myosin V (150 nM) byl inkubován s 0,7 nM kalmodulinu značeného Cy3 a 0,8 nM kalmodulinu značeného Cy5 ve výměnném pufru (25 mM KCl/20 mM imidazol HCl, pH 7,4/2 mM MgCl2/1 mM EGTA) při 22 °C po dobu 2 min. Pro výměnu kalmodulinů bylo přidáno 0,9 mM CaCl2 a směs byla inkubována při 22 °C po dobu 5 min. Reakce byla uhasena 7 mM EGTA. Reakční směs byla nanesena na ultrafiltrační zařízení Nanocep 100K MWCO (Pall) a třikrát promyta stejným objemem AB (níže), aby se přečistil myosin V od přebytečného kalmodulinu.
Příprava průtokové buňky. Průtoková cela byla zkonstruována ze skleněného mikroskopického sklíčka a vysoce lámavých krycích sklíček vyrobených z NLAF21 (VA Optical Labs, San Anselmo, CA), které byly spojeny kousky oboustranné lepicí pásky.
Pro experimenty s myosinem V bylo v průtokové cele inkubováno 15 μl biotinu-BSA (1 mg-ml-1) po dobu 2 minut, poté bylo promyto 30 μl AB pufru (25 mM KCl/25 mM imidazol HCl, pH 7,4/1 mM EGTA/4 mM MgCl2/10 mM DTT/1 mg-ml-1 BSA). Do průtokové buňky bylo přidáno 15 mikrolitrů 0,5 mg/ml NeutrAvidinu (Molecular Probes), který se nechal inkubovat 2 minuty, a poté se provedlo další promytí pufrem AB. Průtoková buňka byla inkubována s 15 μl biotinylovaných aktinových vláken falloidinu (250 nM) po dobu 5 min, poté následovalo promytí 100 μl AB pufrem. Nakonec byla buňka zatížena 20 μl zobrazovacího pufru obsahujícího kalmodulinem vyměněný myosin V, 5 μM kalmodulinu, 300 nM ATP, systém regenerace ATP (0,1 mg-ml-1 kreatinfosfokinázy/1 mM kreatinfosfátu) a 0,5 % (obj.) Triton-X 100 ke snížení nespecifické vazby. Buňka byla uzavřena vakuovým tukem a ihned zobrazena. Konečná koncentrace motoru vedla k řídce zdobenému aktinu a umožnila tak analýzu jednotlivých molekul myozinu V.
Pro experimenty s DNA byly biotin-BSA a NeutrAvidin naloženy stejným způsobem jako pro experimenty s myozinem V, ale promytí bylo provedeno pufrem T50 (10 mM Tris, pH 8,0/50 mM NaCl). Jakmile byla průtoková cela pokryta NeutrAvidinem, bylo vpuštěno 15 μl dsDNA (30 nM) v pufru T50 s 1 mg-ml-1 BSA a inkubováno po dobu 2 min, poté bylo vpuštěno 100 μl zobrazovacího pufru. Poté byla průtoková cela uzavřena vakuovým tukem a ihned zobrazena. Výsledná výzdoba molekul DNA na povrchu byla dostatečně řídká, takže fluorescenční skvrny z různých molekul se zřídka překrývaly.
Nastavení mikroskopu. Mikroskop pro fluorescenci s úplným vnitřním odrazem (TIRF) byl nastaven podle popisu v ref. 8, s některými úpravami (obr. 5, který je zveřejněn jako podpůrná informace na webu PNAS). Excitační zdrojové paprsky o vlnové délce 532 nm (Coherent, Santa Clara, CA) a 633 nm (JDS Uniphase, San Jose, CA) byly kombinovány dichroickým zrcadlem a rozšířeny na průměr 7 mm. Tyto zdroje byly zaostřeny (ohnisková vzdálenost = 500 mm) na zadní ohniskovou rovinu objektivu Olympus 1,65 NA ×100 TIRF pomocí laserového lineárního dichroika na lineárním překladu DeepL, který umožňuje provoz mikroskopu v režimu epifluorescence nebo TIRF. Objektiv byl umístěn pod uzavřenou smyčkou dvouosého piezoelektrického translátoru nanoDeepL vybaveného kapacitními senzory pro měření polohy (Physik Instrumente, Auburn, MA). Odražené světlo vycházející ze zadní clony objektivu bylo nasměrováno na kvadrantovou fotodiodu, která poskytovala signál pro zpětnovazební smyčku zaostřování, která upínala vzdálenost mezi objektivem a vzorkem pomocí elektrostrikčního aktuátoru (Newport, Fountain Valley, CA). Emise fluorescence byla zachycena objektivem, prošla dvěma tenkovrstvými vrubovými filtry StopLine (Semrock, Rochester, NY), jedním pro každý excitační zdroj, a byla přenesena přes aparaturu se dvěma pohledy, která umožnila současné zobrazení kanálů Cy3 a Cy5 na jedné EMCCD kameře iXon DV 887 (Andor Technology, Belfast, Irsko). Všechna data byla zobrazena s integrační dobou 0,5 s. Přeslechy mezi oběma kanály (10 %) pravděpodobně zkreslují měření vzdálenosti směrem k menším hodnotám. Naše experimentální chyba ji však činí nezjistitelnou, jak ukázaly simulace Monte Carlo, při nichž bylo vytvořeno 100 párů modelovaných obrazů jednotlivých fluoroforů oddělených 10 nm a analyzováno identicky jako u dat DNA (popsáno níže). Simulované obrazy fluorescenčních bodových funkcí rozptylu byly vypočteny generováním integrovaného 2D Gaussova rozdělení intenzity s konstantním pozadím, ke kterému byl přidán šum výstřelu. Simulované píky měly stejné rozměry a poměr signál/šum jako skutečné píky. Simulovaná data s 10% přeslechem a simulovaná data bez přeslechu jsou Kolmogorov-Smirnovovým testem nerozlišitelná (N 1 = 100, N 2 = 100, p > 0,05).
Analýza dat. Bylo provedeno registrační mapování kanálů Cy3 a Cy5 s fiduciály tvořenými 100nm kuličkami TransFluoSphere (Molecular Probes). Byly excitovány při vlnové délce 532 nm a emitují široké emisní spektrum. Kuličky byly detekovatelné v obou našich kanálech. Umístili jsme jednu kuličku spojenou s krycím sklíčkem a pomocí piezoelektrického stolku jsme ji krokovali s nanometrovou přesností v mřížkovém vzoru (s roztečí 0,5 μm), přičemž jsme pořídili snímek při každém zastavení. Konečným výsledkem byla hromádka 312 snímků, která zobrazuje kuličku v obou kanálech v různých polohách (obr. 1a ).
Data o DNA byla analyzována domácím softwarem pomocí programu matlab (Mathworks, Natick, MA). Rutina automaticky lokalizuje píky v obraze určením pixelů s vysokou intenzitou a zajistí, aby okolní pixely měly intenzitu podle očekávání pro jeden fluorofor. Před dosazením píků do 2D Gaussovy funkce, abychom získali jejich středy, vyhledáme dvojice píků. Pixely nalezené v kanálu Cy5 se namapují na kanál Cy3 a provede se vyhledání píků v okolních pixelech Cy3. Pokud je nalezen pík, pak jsou pík Cy5 a pík Cy3 považovány za pár pro další analýzu. Každý pík je fitován 2D Gaussovou funkcí v příslušném prostoru, jak je popsáno pro kuličky výše (rovnice 1 ). Chyba střední polohy fitování se vypočítá pomocí počtu nasbíraných fotonů (Nγ), 
Poloha Cy5 se namapuje na kanál Cy3 a vypočítá se vzdálenost mezi nimi. Po výpočetní analýze dat DNA byly identifikované páry fluoroforů ručně prověřeny, aby se zajistilo, že se páry nenacházejí v blízkosti jiných fluoroforů, které by rušily analýzu párů.
Data myozinu V byla analyzována tak, že byl nejprve okem identifikován pohyblivý motor. Podomácku vyrobený software napsaný v programu matlab pak napasoval počáteční dvojici fluorescenčních píků na 2D Gaussovy funkce, jak je popsáno výše, a pokračoval ve sledování píků tak dlouho, jak uživatel určil. Analyzovány byly motory, jejichž konjugovaná barviva každé fotoběhlo v jednom kroku, což byl případ většiny sledovaných motorů, což zajistilo, že jsme skutečně studovali motory s pouze jednou značkou Cy3 a jednou značkou Cy5. Výsledné trajektorie byly registrovány mapováním trajektorie Cy5 na kanál Cy3. Lineární fit nejmenších čtverců na body z obou trajektorií dal orientaci aktinového vlákna, na které byly trajektorie promítnuty. Vzdálenosti podél lineárního uložení (aktinového vlákna) byly vyneseny do grafu v závislosti na čase, aby bylo možné vidět relativní vzdálenosti hlavic (obr. 4).
Časová stopa diferenciálně značené molekuly myozinu V kráčející podél aktinového vlákna. Značky (Cy3 a Cy5) jsou kovalentně navázány na kalmoduliny, které byly vyměněny na molekule myozinu V. Na této stopě se obě místa fluorescenční sondy pohybují po 72 nm, což naznačuje, že kalmoduliny byly vyměněny v blízkosti motorické domény. Střídavé polohy sond umožňují přímé pozorování mechanismu chůze myozinu V z ruky do ruky.
.