PMC

PŘÍLEŽITOST ZLEPŠENÉ TERAPIE POMOCÍ MOLEKULÁRNÍCH STUDIÍ REGULACE FETÁLNÍHO HEMOGLOBINU

Ačkoli výše zmíněné necílené terapeutické přístupy se ukázaly jako slibné a do jisté míry úspěšné při navozování HbF v klinických podmínkách, lepší mechanistické pochopení molekulárních základů nezbytných pro normální přechod z fetálního na dospělý hemoglobin je velkým příslibem, který umožní vyvinout účinnější a specificky cílené přístupy k indukci HbF. V desetiletích následujících po molekulárním klonování globinových genů byla identifikována řada transkripčních faktorů, které hrají roli v regulaci globinových genů (Cantor a Orkin 2002). Patřily mezi ně transkripční faktory jako GATA1, KLF1 a SCL/ TAL1. Studium úlohy těchto faktorů v regulaci globinových genů však bylo ztíženo širokou úlohou těchto faktorů v diferenciaci a jejich pleiotropní rolí jako regulátorů regulace globinových a erytroidních genů. Ukázalo se, že žádný z těchto faktorů není specifickým regulátorem přechodu z fetálního na dospělý hemoglobin. Trvalo téměř tři desetiletí od prvního klonování globinových genů, než byly identifikovány specifické regulátory tohoto procesu.

Důležité poznatky o identitě těchto faktorů přineslo studium přirozené lidské genetické variability. Řada skupin sledovala základy běžné genetické variability v hladinách HbF pomocí cílených i celogenomových asociačních studií (GWAS) (Menzel et al. 2007; Thein et al. 2007; Lettre et al. 2008; Uda et al. 2008). Tyto studie vedly k identifikaci tří genomových lokusů, v nichž se nacházejí společné varianty ovlivňující hladiny HbF. Jednalo se o oblast chromozomu 2 v rámci genu BCL11A, intergenní oblast mezi geny HBS1L a MYB na chromozomu 6 a varianty v rámci β-globinového lokusu na chromozomu 11. Nedávné studie, které podrobněji zmapovaly tyto genetické varianty, naznačují, že >50 % variability hladin HbF lze vysvětlit společnou variabilitou v těchto třech lokusech (Galarneau et al. 2010). Ačkoli se předpokládá, že hladiny HbF mají dědičnou genetickou složku v rozsahu ∼80 %, je důležité mít na paměti, že aditivní genetická variabilita zjištěná ze společných genetických variant ignoruje potenciální genetické interakce vyššího řádu, které nemusí být detekovány, a proto rozsah, v jakém jsou hladiny HbF geneticky determinovány, je třeba ještě prozkoumat v budoucích studiích (Zuk et al. 2012).

Původní pozorování variant spojených s hladinami HbF v rámci transkripčního faktoru BCL11A se zinkovými prsty vedlo k první studii, která sledovala hypotézu, že BCL11A může být regulátorem exprese HbF (Sankaran et al. 2008). Předchozí práce naznačovaly, že BCL11A je kritickým transkripčním regulátorem zapojeným do B lymfopoézy a neurogeneze (Sankaran et al. 2010). Zdálo se, že hladiny proteinu BCL11A korelují s vývojovým stadiem exprese, takže primitivní a fetální jaterní definitivní erytroidní buňky, které exprimovaly vysoké hladiny γ-globinu, měly nízkou nebo žádnou expresi forem BCL11A plné délky. Tento výsledek naznačuje, že tento genový produkt působí jako represor γ-globinových genů. K přímému ověření této skutečnosti bylo u primárních dospělých erytroidních progenitorů provedeno vyřazení BCL11A pomocí krátkovlasé RNA (shRNA) a při takovém vyřazení bylo možné robustně indukovat expresi γ-globinu. Zdá se, že míra indukce γ-globinu souvisí s rozsahem knockdownu BCL11A. Zajímavé je, že navzdory silné indukci γ-globinu nedošlo k výraznějším poruchám erytropoézy. Následné studie ukázaly podobné výsledky při vyřazení exprese BCL11A pomocí shRNA (Borg et al. 2010; Zhou et al. 2010; Wilber et al. 2011). Dále bylo prokázáno, že BCL11A přímo interaguje s chromatinem v lokusu lidského β-globinu v primárních erytroidních buňkách a že zřejmě působí jako součást komplexu s transkripčním faktorem GATA1 a komplexem NuRD pro remodelaci a represi chromatinu (Sankaran et al. 2008). Zajímavé je, že komplex NuRD obsahuje HDAC 1 a 2, které byly navrženy jako kritické HDAC nezbytné pro umlčení HbF (Bradner et al. 2010). Kromě toho bylo navrženo, že transkripční faktor SOX6 může spolupracovat s BCL11A, aby pomohl umlčet geny γ-globinu u lidí, a může být nezbytný pro vazbu proximálního promotoru těchto globinových genů (Xu et al. 2010).

Ačkoli se zdá, že přepínání hemoglobinu u myších modelů, dokonce i u těch, které nesou transgen lidského β-globinového lokusu, se odchyluje od normální ontogeneze exprese globinu pozorované u lidí, byla u myší prokázána evolučně konzervovaná role BCL11A při umlčování a přepínání globinových genů (Sankaran et al. 2009; McGrath et al. 2011). Zdá se, že myši, kterým chybí BCL11A, mají normální erytropoézu, ale nedokážou plně umlčet embryonální globinové geny v definitivních erytroidních buňkách a umožňují určitou přetrvávající expresi γ-globinu, pokud je přítomen intaktní lidský β-globinový lokus. Tato zjištění posilují význam BCL11A jako kritického mediátoru globinového přepínání u savců. Ačkoli se tato původní studie zabývala úlohou BCL11A ve vývojovém procesu přepínání globinů u myší (Sankaran et al. 2009), novější studie použila podmíněnou inaktivaci BCL11A, aby ukázala, že indukovatelná inaktivace může vést k robustní a podobné míře indukce genů γ-globinu, k jaké dochází při inaktivaci v dřívějších časových bodech (Xu et al. 2011). Kromě toho se ukázalo, že ačkoli existuje rozdílná regulace globinových genů u lidí a myší, inaktivace BCL11A je dostatečná ke zlepšení hematologických a patologických rysů pozorovaných u myších modelů srpkovité anémie, což poskytuje důležitý důkaz principu potenciální účinnosti cílení BCL11A na indukci HbF (Xu et al. 2011).

Přesné mechanismy, kterými BCL11A umlčuje expresi γ-globinových genů, zůstávají nejasné. Nedávná studie naznačuje, že to může být zprostředkováno jak interakcemi s transkripčními faktory, jako je SOX6, které vážou chromatin na proximálních promotorech γ-globinu, tak i interakcemi na dlouhé vzdálenosti s různými oblastmi v celém genovém klastru β-globinu (Xu et al. 2010). Pokud BCL11A chybí, změní se konformace β-globinového lokusu tak, že zesilovač nahoře v řetězci, známý jako oblast kontroly lokusu, se ocitne vedle transkripčně aktivovaných γ-globinových genů. K podobnému jevu dochází, když jsou buňky ošetřeny inhibitory HDAC, které indukují expresi genů γ-globinu (Bradner et al. 2010). Není však jasné, zda jsou tyto konformační změny přímo zprostředkovány BCL11A, nebo zda k nim dochází až sekundárně po HbF-indukčním účinku inhibice BCL11A (nebo HDAC). Nicméně tato zjištění silně podporují názor, že BCL11A má zřejmě přímou úlohu při tlumení exprese γ-globinu v rámci β-globinového lokusu. Mapováním různých delecí v lidském β-globinovém lokusu, které mají za následek buď δβ-talasemii s mírným zvýšením HbF a přítomností určité zbývající nerovnováhy globinových řetězců, nebo HPFH s výrazným zvýšením HbF a vyváženou syntézou globinových řetězců, bylo prokázáno, že pro umlčení γ-globinových genů je nezbytná oblast N3-kb před δ-globinovým genem (obr. 2) (Sankaran et al. 2011c). Je zajímavé, že v této oblasti se nacházejí vazebná místa pro BCL11A spolu s jeho partnery, jako jsou GATA1 a HDAC1. Za zmínku stojí, že tato oblast byla také nezávisle na sobě označena za důležitou pro umlčování γ-globinu prostřednictvím studií delece Corfu thalasemie u lidí (Chakalova et al. 2005). Tato studie poskytuje důležité mechanistické poznatky o tom, jak BCL11A funguje při umlčování HbF, a posiluje význam přirozených lidských mutací pro pochopení tohoto vývojového procesu, který je pro člověka jedinečný (obr. 2) (Sankaran et al. 2011c).

Vzhledem k těmto zjištěním bude BCL11A pravděpodobně důležitým terapeutickým cílem. Skutečnost, že její inaktivace indukuje HbF, aniž by vedla k zásadní poruše erytropoézy, je velmi slibná, ačkoli je známo, že má významné účinky i v jiných liniích, jako jsou B lymfocyty, což zdůrazňuje význam modelování a analýzy in vivo jako součásti probíhajících snah o zacílení BCL11A na indukci HbF. Další studie zkoumající mechanismy působení, jimiž BCL11A funguje, by mohly vést k lepším a cílenějším přístupům k indukci HbF (Sankaran et al. 2011c). SOX6 může být také potenciálně slibným cílem pro indukci HbF (Xu et al. 2010), ačkoli je známo, že je nezbytný pro normální erytropoézu (Dumitriu et al. 2006). Byl však popsán pacient s heterozygotním narušením genu SOX6, který neměl zvýšené hladiny HbF, což naznačuje, že gen SOX6 může mít mechanismus pro kompenzaci dávky nebo že může existovat určitý práh nutný pro snížení exprese tohoto genu, aby došlo k robustní indukci HbF (Sankaran et al. 2011a). To naznačuje, že uvažování o genu SOX6 jako o potenciálním cíli indukce HbF může mít svá omezení.

Po prvních studiích o BCL11A dvě studie naznačily, že exprese BCL11A je zřejmě řízena erytroidním specifickým transkripčním faktorem KLF1 za použití nezávislých a vzájemně se doplňujících přístupů. V jedné studii došlo u myší s hypomorfní alelou KLF1 ke zvýšení exprese embryonálního globinu a transgenní myši s lidským β-globinovým lokusem vykazovaly trvalou expresi γ-globinu (Zhou et al. 2010). V důsledku toho badatelé testovali, zda by ke stejné regulaci mohlo docházet i v primárních lidských erytroidních buňkách a zda by mohli prokázat podobnou souvislost pomocí shRNA přístupů. Badatelé pak ukázali, že k tomuto účinku dochází jednak přímým působením KLF1 na lokus β-globinu, ale také prostřednictvím nepřímých účinků zprostředkovaných sníženou expresí BCL11A při vyřazení KLF1. Toto zjištění ukázalo, že KLF1 je přímým pozitivním transkripčním regulátorem exprese BCL11A. Druhá skupina zkoumala genetický základ nespojité formy HPFH, u níž se předpokládá, že je důsledkem missense mutace KLF1 v této rodině (Borg et al. 2010). Těmto badatelům se pomocí primárních buněk od těchto pacientů a od nepostižených kontrol podařilo prokázat, že pozorovaný účinek lze částečně přičíst tlumivému účinku KLF1 na BCL11A. Jedna oblast přetrvávající nejistoty se týká lidských fenotypů pozorovaných u různých případů mutací KLF1. Ačkoli v původní zprávě měli všichni příjemci missense mutace zvýšenou expresi HbF, je třeba poznamenat, že ta se ve skutečnosti pohybovala mezi 3 % a 19 % celkové hladiny hemoglobinu. Kromě toho další zprávy o heterozygotních mutacích KLF1 u lidí buď ukazují současné narušení erytropoézy, nebo vykazují malý vliv na expresi HbF (Arnaud et al. 2010; Satta et al. 2011). Novější studie naznačují, že vzácné varianty KLF1 jsou skutečně spojeny se zvýšením HbF, ale nezdá se, že by k tomu docházelo konzistentně nebo ve stejné míře i u podobných mutací (Gallienne et al. 2012). Základ této varianty je třeba ještě určit a bude důležité lépe pochopit mechanismy, kterými KLF1 působí přímo i nepřímo, aby ovlivnil expresi HbF. To bude mít zásadní význam pro jakoukoli budoucí práci, která se pokusí cílit na KLF1 pro indukci HbF, zejména pokud se chceme vyhnout nežádoucím účinkům takové inhibice na erytroidní diferenciaci. Nicméně vzhledem ke specifičnosti KLF1 v rámci erytroidní linie a pokud by bylo možné specificky cílit na globinový gen regulující aktivitu KLF1, měl by být stále považován za kandidáta na indukci HbF.

Kromě běžných genetických variant identifikovaných u BCL11A spojených s hladinou HbF u lidí studie GWAS ukázaly, že na chromozomu 6 v intergenu mezi geny HBS1L a MYB existují varianty, které mají zřejmě dramatický vliv na hladinu HbF u lidí (Menzel et al. 2007; Thein et al. 2007; Lettre et al. 2008; Uda et al. 2008). Pochopení mechanismu působení, kterým tyto varianty vedou ke změnám hladin HbF, je důležité, protože se zdá, že genetické varianty v tomto lokusu mají stejně velký nebo možná dokonce větší vliv na klinickou morbiditu u β-hemoglobinopatií než varianty v lokusu BCL11A (Galanello et al. 2009; Nuinoon et al. 2010). Zajímavé je, že tato oblast obsahuje řadu regulačních prvků, u nichž se předpokládá, že hrají důležitou roli při regulaci exprese MYB v erytroidních progenitorech (Mukai et al. 2006; Wahlberg et al. 2009; Stadhouders et al. 2011). Ačkoli se nezdálo, že by nadměrná exprese HBS1L měla vliv na expresi γ-globinu v erytroleukemických buňkách K562, zdálo se, že nadměrná exprese MYB ovlivňuje úroveň γ-globinu produkovaného v těchto buňkách (Jiang et al. 2006). Navíc kultury primárních erytroidních progenitorů od lidí s vyšší expresí HbF měly častěji sníženou expresi MYB (Jiang et al. 2006).

V návaznosti na klasické klinické pozorování, že pacienti s trizomií chromozomu 13 mají opožděný přechod z fetálního na dospělý hemoglobin a nadále mají přetrvávající expresi HbF (Huehns et al. 1964; Sankaran a Sapp 2012), poskytly nedávné studie další důkazy o roli MYB v regulaci exprese HbF. Jemným mapováním a provedením integrativní genomické analýzy genů v oblasti na chromozomu 13, která je považována za nezbytnou pro zvýšení HbF pozorované u pacientů s částečnými trizomiemi chromozomu 13, bylo zjištěno, že existují dvě malé ∼22 nukleotidové molekuly RNA, které jsou nejlepšími kandidáty na provádění takové činnosti, mikroRNA 15a a 16-1 (Sankaran a kol. 2011b). Nadměrná exprese těchto mikroRNA v primárních dospělých erytroidních buňkách v kultuře vedla ke zvýšení produkce γ-globinu. Při zkoumání cílů těchto mikroRNA bylo zjištěno, že jedním z hlavních cílů v erytroidních buňkách je MYB. Přímé vyřazení MYB v primárních dospělých erytroidních progenitorech vedlo k dramatickému zvýšení produkce γ-globinu (Sankaran et al. 2011b), což spojuje toto historické pozorování ze vzácného lidského aneuploidního syndromu s novějšími pracemi zkoumajícími molekulární mechanismy regulující hladinu HbF.

Mechanismus, kterým může MYB působit na regulaci hladiny HbF, zůstává nejasný. Může to být díky vlivu na kinetiku erytropoézy, případně k tomu může docházet i v důsledku přímého účinku v rámci β-globinového lokusu (Higgs a Wood 2008). K prozkoumání těchto mechanismů bude zapotřebí další práce a jsou velkým příslibem při pokusech o terapeutické zacílení této molekuly na indukci HbF. Existují obavy, že cílení na MYB by mohlo mít nežádoucí vedlejší účinky, zejména vzhledem k pleiotropní roli MYB v krvetvorbě (Emambokus et al. 2003; Carpinelli et al. 2004). Nedávná práce však naznačuje, že takové strategie mohou být ve skutečnosti slibné, protože částečné vyřazení MYB u myší mělo jen malý vliv na normální krvetvorbu in vivo a zároveň dramaticky blokovalo progresi leukemií (Zuber et al. 2011a). Částečná inhibice MYB proto může být slibnou strategií pro indukci HbF. Aditivita účinků variant v intergenové oblasti HBS1L-MYB spolu s variantami v lokusu BCL11A (Lettre et al. 2008; Galanello et al. 2009; Nuinoon et al. 2010) naznačuje, že cílení na obě tyto dráhy společně by mohlo přinést ještě výraznější účinky než cílení na jednu z těchto drah samostatně.

Ačkoli výše zmíněné regulátory regulace HbF byly nalezeny na základě genetických studií u lidí, čímž se potvrdil jejich význam in vivo u člověka, byla na základě různých studií využívajících přístupy buněčných kultur nebo myších modelů (tabulka 1) navržena také řada dalších molekul, které hrají roli v regulaci γ-globinových genů. Tyto molekuly budou popsány níže. Je důležité mít na paměti, že většina v současnosti dostupných experimentálních systémů používaných ke studiu regulace genu γ-globinu má svá omezení. Zdá se, že primární lidské erytroidní buňky jsou tolerantní k manipulaci, která umožní zvýšení produkce γ-globinu, což nemusí být vždy relevantní u lidí in vivo. Kromě toho mnoho podnětů, o nichž je známo, že indukují produkci γ-globinu in vivo u lidí, včetně různých typů stresové erytropoézy a léčby hydroxyureou, nefunguje tak, aby indukovaly produkci γ-globinu v humanizovaných myších modelech (Pace et al. 1994; Sankaran et al. 2009), což zdůrazňuje důležité omezení pro interpretaci negativních zjištění v tomto experimentálním systému. Při interpretaci experimentálních nálezů, které nejsou podloženy důkazy z humánních genetických studií nebo studií provedených na lidech či primátech in vivo, je tedy třeba postupovat opatrně

Zkoumáním proteinů, které vážou přímé opakující se elementy nacházející se v promotoru γ-globinových genů, bylo navrženo, že sirotčí receptory jaderných hormonů TR2 a TR4 hrají roli represorů exprese γ-globinových genů (Tanabe et al. 2002, 2007; Cui et al. 2011). Paradoxně nadměrná exprese TR2 a TR4 v transgenních myších modelech vede ke zvýšené expresi γ-globinu a při nadměrné expresi v myších modelech srpkovité choroby může vést k částečnému zlepšení hematologických a patologických příznaků těchto myší (Campbell et al. 2011). Mechanismy, které jsou základem těchto pozorování, a jejich význam pro regulaci lidských globinových genů je třeba pro TR2 a TR4 teprve stanovit. Kromě toho bylo také navrženo, že jaderný receptor COUP-TFII, který je sirotčím jaderným hormonem, se váže na přímé repetice a potlačuje promotor γ-globinu u lidí (Filipe et al. 1999). Pomocí in vitro kultur primárních dospělých erytroidních buněk bylo prokázáno, že cytokiny, jako je SCF, zřejmě snižují expresi a obsazení chromatinu COUP-TFII v β-globinovém lokusu, což vede ke zvýšení exprese γ-globinu (Aerbajinai et al. 2009). Přímá down-regulace COUP-TFII pomocí malých interferujících RNA (siRNA) by navíc mohla vést ke zvýšení produkce γ-globinu (Aerbajinai et al. 2009). K lepšímu pochopení fyziologické role COUP-TF v regulaci HbF bude zapotřebí dalších studií.

Nedávné studie také naznačily roli genu pojmenovaného přítel PRMT1 (FOP1) v represi genové exprese γ-globinu (van Dijk et al. 2010). Knockdown FOP1 vede ke zvýšené expresi HbF v lidských dospělých erytroidních buňkách v kultuře. Předpokládá se, že je to zprostředkováno sníženou expresí SOX6, o němž je známo, že knockdown rovněž vede ke zvýšení produkce γ-globinu (Xu et al. 2010). K potvrzení těchto zjištění, pochopení, zda má tento gen také širší roli v erytropoéze, a prozkoumání mechanismu, který je základem těchto pozorování, bude zapotřebí další práce.

Některé studie také naznačily roli stadiálního selekčního proteinu NF-E4 jako aktivátoru exprese γ-globinu u lidí (Jane et al. 1995; Zhao et al. 2006). Předpokládá se, že krátká forma NF-E4 může mít úlohu při potlačování γ-globinových genů tím, že inhibuje normální aktivační funkci NF-E4 na promotoru těchto genů (Zhou et al. 2004). Všechny tyto studie byly založeny na experimentech prováděných na kultivovaných buňkách a biochemické purifikaci proteinových komplexů z buněk K562, a proto bude zapotřebí další práce k potvrzení fyziologické role tohoto genu v expresi γ-globinu a lepšímu pochopení mechanismů, kterými tento komplex může působit na změnu regulace lidských globinových genů.