Patogeneze in vitro
Sloupcové epitelové buňky jsou mrtvé buňky, které zažívají dva extrémy pH najednou. Apikálně jsou omývány vysoce alkalickými střevními tekutinami a bazálně jsou omývány mírně kyselou hemolymfou. Tyto podmínky je obtížné napodobit v buněčné kultuře, což může být příčinou nedostatku dostupných informací o primární infekci.
Buněčné linie, které podporují replikaci GV, jsou vzácné a v současné době existují pouze pro CpGV. V důsledku toho víme o mechanismech infekce GV jen o málo více než o infekci ODV. Přesto víme, že během morfogeneze nukleokapsidů GV dochází k rozpadu jaderné membrány hostitelské buňky, což je událost, která nenarušuje zpracování nukleokapsidů. Zánik jaderné membrány je charakteristický a nedochází k němu u hostitelských buněk infikovaných NPV.
Byla vytvořena řada buněčných linií hmyzu, které podporují infekci NPV. Většina buněčných linií je odvozena z vaječníků nebo embryí housenek. AcMNPV se může replikovat v buněčných liniích odvozených z několika druhů hmyzu, což přispívá k tomu, že je nejlépe prostudovaným bakulovirem. Při standardní jednostupňové růstové křivce vznikají AcMNPV BV obvykle 12-20 h po infekci (hpi) a okluze 20-48 hpi. Replikace většiny ostatních NPV v buněčné kultuře trvá o hodiny až dny déle.
AcMNPV BV je 1000krát infekčnější než ODV, především díky přítomnosti jeho fúzního proteinu GP64. BV vstupují do cílových buněk pomocí klatrinem zprostředkované endocytózy. Nukleokapsidy BV pronikají hluboko do cytoplazmy cílových buněk tím, že se uvolňují z endozomů. Pomocí této strategie nukleokapsidy obcházejí pravděpodobně nebezpečné prostředí, které se nachází těsně pod plazmatickou membránou, a vstupují do buňky blíže k jádru, než by umožnila fúze na plazmatické membráně. Konformační posuny citlivé na pH, ke kterým dochází u fúzních proteinů BV, slouží ke spuštění fúzní události mezi virovým obalem a endozomální membránou.
Po úniku nukleokapsidu AcMNPV z endozomu následuje okamžitě jeho spojení s F-aktinovými kabely. Tvorba kabelů je přechodná a dochází k ní v době, kdy se virové nukleokapsidy přesouvají do jádra a vstupují do něj. Během přechodu se virové nukleokapsidy kolokují s jedním koncem aktinového kabelu, pravděpodobně prostřednictvím P78/83, proteinu vázajícího F-aktin, o němž se předpokládá, že se nachází u základny nukleokapsid. Spojení nukleokapsid s F-aktinovými kabely a zpoždění exprese reportérových genů v přítomnosti léků, které narušují funkci aktinu/myozinu, naznačují, že kabely mohou usnadňovat transport nukleokapsid do jádra nebo zprostředkovávat jejich průchod jadernými póry.
Nukleokapsidy virů NPV a některých virů GV vstupují do jader prostřednictvím jaderných pórů. Některé GV se rozbalují v jaderných pórech, ale většina bakulovirů se rozbaluje uvnitř jádra. Okamžitě začíná časná transkripce genů, kterou zprostředkovává hostitelská RNA polymeráza II (Pol II). Mezi exprimovanými časnými geny je podskupina, jejíž exprese vede k účinnému transportu G-aktinu do jádra a jeho akumulaci v něm (obrázek 5). Tato efektní manipulace s lokalizací aktinu je kritická pro produkci potomstva NPV a nebyla popsána u žádného jiného patogenu. Mezi geny podílející se na jaderné lokalizaci aktinu, které byly identifikovány v pokusech s transientní transfekcí, patří ie1, pe38, Ac004, Ac152, he65 a Ac102. Dva z těchto genů, ie1 a Ac102, jsou konzervovány mezi všemi NPV a GV lepidopter a oba jsou esenciální.
Obr. 5. Geny pro lokalizaci aktinu. Jaderný G-aktin v buňkách infikovaných AcMNPV. (a) infikované buňky obarvené 4′,6-diamidino-2-fenylindolem (DAPI); (b) infikovaná buňka exprimující transfekovaný zelený fluorescenční protein (GFP)-aktin. (c) Nedostatek jaderného barvení rhodamin-falloidinem naznačuje, že jaderný aktin je monomerní.
Přechod do pozdní fáze infekce je začátkem období produkce potomstva BV; buněčné aktivity jsou zaměřeny na syntézu virových složek maximální rychlostí, jejich sestavení do produktů nukleokapsid a jejich následný export. Syntéza makromolekul hostitele je v tomto období zastavena, ale chromatinová struktura hostitele zůstává neporušená až do buněčné smrti. Pozdní a velmi pozdní virové geny jsou exprimovány RNA polymerázou kódovanou virem.
Mikrotubuly, reorganizované během časné fáze infekce, jsou depolymerizovány faktory produkovanými během pozdní fáze, což vede k zaoblení buněk (obrázek 6). Podobně G-aktin, nahromaděný v jádře během časné fáze, polymerizuje během pozdní fáze současně s jaderným otokem a vymizením viditelných jaderných struktur hostitele (obrázek 7). Virogenní stroma, místo syntézy virové DNA, se tvoří ve středu jádra a je protkáno a obklopeno elektronově průsvitnou zónou zvanou „zóna prstence“, místem, kde jsou kapsidy sestaveny a upoutány během načítání genomu. Jaderný F-aktin se v prstencové zóně kolokuje s hlavním proteinem kapsidy AcMNPV (Obrázek 7).
Obrázek 6. Buňky Sf21 infikované AcMNPV vykazující různé fáze cytopatického účinku (CPE). (a) Neinfikované buňky. Povšimněte si tvaru vřeténka a přítomnosti nukleochromatinových struktur. (b) Buňky infikované AcMNPV vykazující časný a pozdní CPE. Buňky jsou zaoblené v důsledku depolymerizace mikrotubulů, jádra jsou větší a zbavená hostitelských struktur a virogenní stroma (vs) je obklopeno prstencovou zónou (rz). Virogenní stroma je s postupující pozdní fází infekce hustší. Polyedry vyplňují jádro ve velmi pozdní fázi infekce (p).
Obrázek 7. Znázornění jádra. Jaderný F-aktin v buňce infikované AcMNPV během pozdní genové exprese. (a) Barvení DAPI označuje umístění jádra. (b) Zelená fluorescence ukazuje, že kapsidový protein je lokalizován především v prstencové zóně jádra. (c) Barvení rhodaminovým falloidinem ukazuje, že F-aktin se kolokuje s kapsidem v prstencové zóně.
Jaderný F-aktin je nutný pro produkci BV. V přítomnosti léčiv narušujících F-aktin jsou virové kapsidy malformované a jeví se jako dlouhé tubulární struktury přiléhající k vnitřní jaderné membráně s řídkými skvrnami elektronově hustého materiálu. Základní desky a struktury víček, které jsou normálně přítomny, nejsou patrné a vzniká nadbytek membránových profilů. Syntéza virové DNA probíhá normální rychlostí, ale genomy nejsou zabaleny a virogenní stroma má ve srovnání s normálním stroma „uvolněný“ vzhled. Zajímavé je, že fenotyp při nepřítomnosti AcMNPV very late factor-1 (VLF-1) je podobný, což naznačuje, že VLF-1 se může podílet na připoutání kapsid k virogennímu stromatu a že F-aktin je složkou stromatu, ke které jsou kapsidy přímo nebo nepřímo připoutány.
P78/83, minoritní kapsidový protein exprimovaný pozdě během infekce, je nezbytný pro životaschopnost AcMNPV. Tato vlastnost byla zaznamenána před více než 30 lety a využita v prvních komerčních expresních soupravách pro bakuloviry. Předpokládá se, že P78/83 (78 kDa, když je nefosforylovaný, a 83 kDa, když je fosforylovaný) je součástí základních destiček kapsid BV i ODV. P78/83 je protein vázající F-aktin a tato aktivita může pomáhat připoutat kapsidy k jaderné matrix během sestavování. Zajímavé je, že P78/83 obsahuje další aktivitu, která vysvětluje, proč je nezbytný; podporuje polymerizaci aktinu v jádře. P78/83 obsahuje domény konzervované u členů rodiny Wiskott-Aldrichova syndromu (WASP), což jsou faktory, které podporují nukleaci aktinových filament. Členové rodiny WASP pozitivně regulují aktinovou nukleační aktivitu komplexu Actin Related Protein (Arp)-2/3. Tento sedmipodjednotkový komplex, konzervovaný napříč eukaryoty, je v buňkách infikovaných AcMNPV translokován do jádra a je aktivován P78/83. Mutace v P78/83, které vedou ke snížené schopnosti podporovat nukleaci aktinu, vedou odpovídajícím způsobem ke snížené schopnosti produkovat infekční BV.
Hned po vstupu do jádra přijímá DNA AcMNPV strukturu podobnou nukleozomu a při replikaci genomu využívá nukleozomy a procesy související s nukleozomy. Zdá se tedy, že součástí virové replikační strategie je únos složek, ne-li celé schopnosti remodelace chromatinu hostitele. Nejnovější důkazy naznačují, že se na tomto procesu pravděpodobně podílí rodina proteinů BRO (baculovirus repeated orf). Proteiny BRO se exprimují na počátku infekce, vážou jednořetězcovou DNA (ssDNA) a jádrové histony a při frakcionačních experimentech se rozdělují s histony. BmNPV, orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus a lymantria dispar multiple nucleopolyhedrovirus mají více genů Bro. AcMNPV nese pouze jeden gen bro, příbuzný s BmNPV bro-d, který je nezbytný.
Prostřednictvím AcMNPV kódovaný P6.9, vysoce základní obalový protein genomu, se začíná hromadit v pozdní fázi infekce a vzniká alternativní struktura chromatinu.
Interakce P6.9-DNA jsou řízeny fosforylačním stavem P6.9.
. Během balení genomu se genomová DNA z virogenního stromatu váže s P6.9, protože P6.9 je defosforylován a kondenzuje do předem vytvořeného pláště kapsidy otvorem v kónické koncové struktuře. Kuželovité struktury leží proximálně od virogenního stromatu s kapsidovým pláštěm uzavřeným základními destičkami, které se distálně rozšiřují do prostoru s menší elektronovou hustotou, do prstencové zóny. F-aktin a kapsidový protein se společně s P78/83 a komplexem Arp2/3 lokalizují v prstencové zóně. Právě tato fáze replikace je ovlivněna jak léky, které narušují F-aktin, tak nepřítomností VLF-1.
S nástupem velmi pozdní fáze infekce dochází ke snížení produkce BV a nastupuje produkce ODV. Nově sestavené nukleokapsidy zůstávají v jádře, kde jsou zabaleny do obalů, o nichž se předpokládá, že pocházejí z vnitřní jaderné membrány. Obalené viriony, ale nikoli neobalené nukleokapsidy, se uzavírají do bílkovinné matrice a vytvářejí kapsle nebo polyedry. Buňky nakonec lyzují a uvolňují okluze do prostředí.
.