Patogenese In Vitro
Columnar epithelial cells are dead-end cells that experience two extremes of pH at once. Apikalt er de badet i stærkt basiske tarmvæsker, og basalt er de badet i svagt sur hæmolymph. Disse forhold er vanskelige at efterligne i cellekultur, hvilket kan være årsagen til de få oplysninger, der er tilgængelige om primær infektion.
Cellelinjer, der understøtter GV-replikation, er sjældne og findes i øjeblikket kun for CpGV. Derfor ved vi ikke meget mere om mekanismerne for GV-infektion, end vi gør om ODV-infektion. Alligevel ved vi, at under GV-nukleokapsid-morfogenese opløses værtscellens kernemembran, en begivenhed, der ikke forstyrrer behandlingen af nukleokapsidet. Forsvindingen af kernemembranen er karakteristisk og forekommer ikke i NPV-inficerede værtsceller.
Der er blevet etableret en række insektcellelinjer, der understøtter NPV-infektioner. De fleste af cellelinjerne stammer fra larvers æggestokke eller embryoner. AcMNPV kan replikere i cellelinjer, der stammer fra flere insektarter, hvilket er medvirkende til, at det er det bedst undersøgte baculovirus. I en standardvækstkurve i ét trin produceres AcMNPV BV’er typisk 12-20 timer efter infektion (hpi) og okklusioner 20-48 timer efter infektion (hpi). Replikation af de fleste andre NPV’er i cellekultur tager timer til dage længere tid.
AcMNPV BV er 1000 gange mere smitsomt end ODV, primært på grund af tilstedeværelsen af dets fusionsprotein, GP64. BV’er kommer ind i deres målceller ved clathrinmedieret endocytose. BV-nukleokapsider trænger dybt ind i målcellens cytoplasma ved at blive frigivet fra endosomer. Ved hjælp af denne strategi omgår nukleokapsiderne det muligvis farlige miljø, der ligger lige under plasmamembranen, og kommer ind i cellen tættere på kernen, end fusion ved plasmamembranen ville tillade. De pH-følsomme konformationsforskydninger, som BV-fusionsproteinerne oplever, tjener til at udløse en fusionsbegivenhed mellem virushylstret og den endosomale membran.
AcMNPV-nukleokapsids’ flugt fra endosomet efterfølges straks af dets associering med F-actin-kabler. Kabeldannelsen er forbigående og sker i den tid, hvor virale nukleokapsider bevæger sig til og kommer ind i kernen. Under transitten samlokaliseres virale nukleokapsider med den ene ende af et actinkabel, muligvis via P78/83, et F-actinbindende protein, som menes at være placeret ved basen af nukleokapsiderne. Foreningen af nukleokapsider med F-actin-kabler og forsinkelsen af reportergenekspression i tilstedeværelsen af lægemidler, der forstyrrer actin/myosin-funktionen, tyder på, at kablerne kan lette transporten af nukleokapsider til kernen eller formidle deres passage gennem nukleare porer.
NPV og nogle GV-nukleokapsider kommer ind i kerner via nukleare porer. Nogle GV’er afcoater ved kerneporerne, men det meste af baculovirus-afcoatningen sker inden for kernen. Den tidlige gentranskription begynder straks og formidles af værtens RNA-polymerase II (Pol II). Blandt de tidlige gener, der udtrykkes, er en delmængde, hvis ekspression fører til effektiv G-actin-transport til og ophobning i kernen (figur 5). Denne spektakulære manipulation af aktinlokalisering er afgørende for NPV-produktion af afkom og er ikke beskrevet for nogen anden patogen. De gener, der er involveret i aktinets nukleare lokalisering, og som er identificeret i transiente transfektionseksperimenter, omfatter ie1, pe38, Ac004, Ac152, he65 og Ac102. To af generne, ie1 og Ac102, er bevaret blandt alle lepidopteriske NPV’er og GV’er, og begge er essentielle.
Figur 5. Nuklear G-actin i AcMNPV-inficerede celler. (a) 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-farvede inficerede celler; (b) inficeret celle, der udtrykker transficeret grøn fluorescerende protein (GFP)-actin. (c) Manglende nukleær rhodamin phalloidinfarvning indikerer, at det nukleare actin er monomerisk.
Overgangen til det sene infektionsstadium er begyndelsen på BV-progenyproduktionsperioden; cellulære aktiviteter er rettet mod at syntetisere virale komponenter med maksimal hastighed, samle dem til nukleokapsidprodukter og derefter eksportere dem. Værtens makromolekylære syntese lukkes ned i denne periode, men værtens kromatinstruktur forbliver intakt indtil celledøden. Sene og meget sene virale gener udtrykkes af en RNA-polymerase, der er kodet af virussen.
Mikrotubuli, der er reorganiseret i den tidlige fase af infektionen, depolymeriseres af faktorer, der produceres i den sene fase, hvilket fører til afrunding af cellen (figur 6). På samme måde polymeriseres G-actin, der akkumuleres i kernen i den tidlige fase, i den sene fase, samtidig med at kernen svulmer op og de synlige værtskernestrukturer forsvinder (figur 7). Det virogene stroma, hvor den virale DNA-syntese finder sted, dannes i midten af kernen og er gennemsat og omgivet af en elektronlysende zone kaldet “ringzonen”, et sted, hvor kapsiderne samles og bindes fast under indlæsning af genomet. Nuclear F-actin co-localizes with the major AcMNPV capsid protein in the ring zone (Figur 7).
Figur 6. AcMNPV-inficerede Sf21-celler, der demonstrerer forskellige faser af cytopatisk effekt (CPE). (a) Uinficerede celler. Bemærk spindelform og tilstedeværelse af nukleokromatinstrukturer. (b) AcMNPV-inficerede celler, der viser tidlig og sen CPE. Cellerne er afrundede på grund af depolymeriserende mikrotubuli, kerner er større og renset for værtsstrukturer, og virogene stroma (vs) er omgivet af ringzone (rz). Virogene stromaer bliver tættere, efterhånden som den sene fase af infektionen skrider frem. Polyedre fylder kernen i det meget sene infektionsstadium (p).
Figur 7. Nuklear F-actin i AcMNPV-inficeret celle under sen genekspression. (a) DAPI-farve angiver kernenes placering. (b) Grøn fluorescens indikerer, at capsidprotein primært er lokaliseret i ringzonen af kernen. (c) Rhodamin phalloidinfarvning viser, at F-actin samlokaliseres med capsid i ringzonen.
Nukleært F-actin er nødvendigt for BV-produktion. I tilstedeværelse af F-actin-forstyrrende stoffer er virale kapsider misdannede og fremstår som lange rørformede strukturer ved siden af den indre kernemembran med sjældne pletter af elektron-tæt materiale. De bundplader og kapselstrukturer, der normalt er til stede, er ikke tydelige, og der produceres et overskud af membranprofiler. Den virale DNA-syntese sker med normal hastighed, men genomerne er ikke pakket, og det virogene stroma har et “afslappet” udseende i forhold til normalt stroma. Interessant nok er fænotypen for fravær af AcMNPV very late factor-1 (VLF-1) tilsvarende, hvilket tyder på, at VLF-1 kan være involveret i at binde kapsiderne til det virogene stroma, og at F-actin er en komponent af stromaet, som kapsiderne er knyttet til, direkte eller indirekte.
P78/83, et mindre kapsidprotein, der udtrykkes sent under infektionen, er afgørende for AcMNPV’s levedygtighed. Denne egenskab blev bemærket for over 30 år siden og udnyttet i de første kommercielle baculovirusekspressionskits. P78/83 (78 kDa, når det er ikke-fosforyleret, og 83 kDa, når det er fosforyleret) menes at være en del af basispladerne i både BV- og ODV-kapsiderne. P78/83 er et F-actinbindende protein, og denne aktivitet kan være med til at binde kapsiderne til kernematrixen under samlingen. Interessant nok indeholder P78/83 en anden aktivitet, der forklarer, hvorfor det er vigtigt; det fremmer actinpolymerisation i kernen. P78/83 indeholder domæner, der er bevaret i Wiskott-Aldrich syndrom protein (WASP) familiemedlemmer, faktorer, der fremmer kernedannelse af aktinfilamenter. Medlemmer af WASP-familien regulerer positivt den aktin-nukleerende aktivitet af det aktin-relaterede protein (Arp)-2/3-kompleks. Det syv underenhedskompleks, der er bevaret på tværs af eukaryoter, translokeres til kernen i AcMNPV-inficerede celler og aktiveres af P78/83. Mutationer i P78/83, der fører til nedsat evne til at fremme aktinkernedbrydning, fører tilsvarende til nedsat evne til at producere infektiøs BV.
Med det samme, når AcMNPV-DNA kommer ind i kernen, antager det en nukleosomlignende struktur og anvender nukleosomer og nukleosomrelaterede processer i genomreplikering. En del af den virale replikationsstrategi synes derfor at være at kapre komponenter af, om ikke hele, værtens kromatinomformningskapacitet. Nylige beviser tyder på, at BRO-proteinsfamilien (baculovirus repeated orf) sandsynligvis deltager i denne proces. BRO-proteinerne udtrykkes tidligt under infektionen, binder enkeltstrenget DNA (ssDNA) og kernehistoner og fordeler sig med histoner i fraktioneringseksperimenter. BmNPV, orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus og lymantria dispar multiple nucleopolyhedrovirus har alle flere bro-gener. AcMNPV bærer kun ét bro-gen, der er beslægtet med BmNPV bro-d, som er essentielt.
AcMNPV-kodet P6.9, det meget basiske genompakningsprotein, begynder at akkumulere i den sene fase af infektionen, og der opstår en alternativ kromatinstruktur.
P6.9-DNA-interaktionerne styres af fosforyleringstilstanden af P6.9. Under genompakning binder det genomiske DNA fra det virogene stroma med P6.9, når P6.9 er affosforyleret, og kondenserer sig til en præformet kapsidskede gennem en åbning i en konisk endestruktur. De koniske strukturer ligger proximalt i forhold til det virogene stroma, hvor kapsidskederne er dækket af basisplader, der strækker sig distalt ind i et mindre elektrontæt rum, ringzonen. F-actin og capsidprotein samlokaliseres i ringzonen sammen med P78/83 og Arp2/3-komplekset. Det er denne replikationsfase, der påvirkes både af lægemidler, der forstyrrer F-actin, og af fraværet af VLF-1.
Med indtræden af den meget sene fase af infektionen er der en reduktion i BV-produktionen, og der er indtræden af ODV-produktion. Nyligt sammensatte nukleokapsider forbliver inden for kernen, hvor de er pakket ind i hylstre, som menes at stamme fra den indre kernemembran. De omsluttede virioner, men ikke de uomsluttede nukleokapsider, bliver lukket inde i en proteinmatrix for at danne kapsler eller polyedre. Cellerne lyser til sidst og frigiver okklusionerne i mediet.