Materialer og metoder
Duplex DNA-fremstilling. For at fremstille 30-bp duplex-DNA-molekyler blev to oligonukleotider med følgende sekvens og modifikationer hybridiseret (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Oligonukleotidet 5′-GGGTATATGGAGAGATATTTTTAGCGGAGAGTGACAGAGC-3′ blev mærket med Cy5 i 5′-enden og med Cy3 i 3′-enden. Det komplementære oligonukleotid blev mærket med biotin i begge ender.
Ekspression og oprensning af protein. Genet for gult fluorescerende protein (YFP) i p2Bac/pFastBac-YFP-M5-CaM-plasmidet (en gave fra H. Lee Sweeney, University of Pennsylvania, Philadelphia) blev slettet ved PCR. Det resulterende p2Bac/pFastBac-M5-CaM-plasmid koder for kyllingemyosin V, som er afkortet ved Glu-1099. En leucin lynlås fulgte den native coiled coil for at sikre dimerisering. For at lette oprensningen blev myosin V-proteinet N-terminalt tagget med et FLAG-tag (DYKDDDDDDK). Der blev genereret to rekombinante baculovirus til proteinekspression i Sf9-celler. Den ene koder for det afkortede myosin V og Drosophila melanogaster calmodulin, der er afledt af p2Bac/pFastBac-M5-CaM plasmidet. Den anden virus kodede for den humane essentielle lette kæde, der stammer fra p2Bac/pFastBac-ELC-plasmidet. Begge vira blev anvendt til co-infektion af Sf9-celler. Proteinet blev udtrykt og oprenset som beskrevet af Sweeney et al. (20).
Calmodulin-mærkning og -udveksling. Calmodulin blev udtrykt og mærket med Cy3 eller Cy5 på følgende måde: Et enkelt cystein blev indført i søpindsvin-calmodulin ved hjælp af mutationen Q143C. Dette calmodulin blev udtrykt i Escherichia coli og oprenset som beskrevet i ref. 21. Calmodulinet blev mærket med enten Cy3-maleimid eller Cy5-maleimid (Amersham Biosciences) stamopløsninger (i DMSO) i et 1,4-dobbelt molforhold i 20 minutter. Overskydende farvestof blev fjernet ved gelfiltrering i udvekslingsbuffer (nedenfor), efterfulgt af hydrofob absorption natten over på BioBeads (Bio-Rad). Mærkningsindarbejdelsen var 102 % for Cy3-calmodulin og 75 % for Cy5-calmodulin. Alikvotes blev opbevaret ved -80°C.
Udvekslingen af mærket calmodulin på myosin V blev udført som beskrevet, men med nogle ændringer (22). Myosin V (150 nM) blev inkuberet med 0,7 nM Cy3-mærket calmodulin og 0,8 nM Cy5-mærket calmodulin i udvekslingsbuffer (25 mM KCl/20 mM imidazol HCl, pH 7,4/2 mM MgCl2/1 mM EGTA) ved 22°C i 2 minutter. For at udskifte calmoduliner blev der tilsat 0,9 mM CaCl2, og blandingen blev inkuberet ved 22 °C i 5 min. Reaktionen blev slukket med 7 mM EGTA. Reaktionsblandingen blev påført en 100K MWCO Nanocep ultrafiltreringsanordning (Pall) og vasket tre gange med lige store mængder AB (nedenfor) for at rense myosin V fra overskydende calmodulin.
Forberedelse af flowcelle. Flowcellen blev konstrueret med et glasmikroskopglas og stærkt lysbrydende dækglas fremstillet af NLAF21 (VA Optical Labs, San Anselmo, CA), der blev holdt sammen af stykker dobbeltklæbende Scotch tape.
Til myosin V-eksperimenterne blev 15 μl biotin-BSA (1 mg-ml-1) inkuberet i flowcellen i 2 min, hvorefter 30 μl AB-buffer (25 mM KCl/25 mM imidazol HCl, pH 7,4/1 mM EGTA/4 mM MgCl2/4 mM MgCl2/10 mM DTT/1 mg-ml-1 BSA) blev passeret gennem flowcellen for at skylle den ud. Femten mikroliter 0,5 mg/ml NeutrAvidin (Molecular Probes) blev tilsat til cellen og fik lov til at inkubere i 2 min, hvorefter der blev foretaget endnu en vask med AB-buffer. Flowcellen blev inkuberet med 15 μl biotinylerede phalloidin-aktinfilamenter (250 nM) i 5 min, hvorefter der blev foretaget en 100-μl vask med AB-buffer. Endelig blev cellen belastet med 20 μl billeddannelsesbuffer, herunder calmodulin-udskiftet myosin V, 5 μM calmodulin, 300 nM ATP, et ATP-regenereringssystem (0,1 mg-ml-1 kreatinphosphokinase/1 mM kreatinphosphat) og 0,5 % (vol/vol) Triton-X 100 for at reducere uspecifik binding. Cellen blev forseglet med vakuumfedt og afbildet med det samme. Den endelige motorkoncentration resulterede i sparsomt dekoreret aktin og muliggjorde således en analyse af enkelte myosin V-molekyler.
For DNA-eksperimenterne blev biotin-BSA og NeutrAvidin indlæst på samme måde som for myosin V-eksperimenterne, men vaskningerne blev foretaget med T50-buffer (10 mM Tris, pH 8,0/50 mM NaCl). Når flowcellen havde en NeutrAvidin-belægning, blev 15 μlof dsDNA (30 nM) i T50-buffer med 1 mg-ml-1 BSA strømmet ind og inkuberet i 2 min, hvorefter 100 μl billeddannelsesbuffer blev strømmet ind. Flowcellen blev derefter forseglet med vakuumfedt og straks afbildet. Den resulterende dekoration af DNA-molekyler på overfladen var tilstrækkelig sparsom, at fluorescerende pletter fra forskellige molekyler sjældent overlappede hinanden.
Mikroskopopsætning. TIRF-mikroskopet (total intern refleksionsfluorescens) blev opstillet som beskrevet i ref. 8, med nogle ændringer (Fig. 5, som er offentliggjort som understøttende information på PNAS-webstedet). Excitationskildestråler ved 532 nm (Coherent, Santa Clara, CA) og 633 nm (JDS Uniphase, San Jose, CA) blev kombineret af et dichroisk spejl og udvidet til en diameter på 7 mm. Disse kilder blev fokuseret (fokallængde = 500 mm) på det bageste fokusplan på et Olympus 1,65 NA ×100 TIRF-objektiv med et laserlinjedichroisk spejl på en lineær DeepL translation, der tillader mikroskopdrift i enten epifluorescens- eller TIRF-tilstand. Objektivet blev placeret under en lukket to-akset piezo nanoDeepL-translation med to akser, der er udstyret med kapacitive sensorer til positionsmåling (Physik Instrumente, Auburn, MA). Det reflekterede lys, der kom ud af objektivets bageste åbning, blev rettet mod en kvadrantfotodiode for at give et signal til en fokusfeedbacksløjfe, der fastspændte afstanden mellem objektivet og prøven med en elektrostriktiv aktuator (Newport, Fountain Valley, CA). Fluorescensemissionen blev opsamlet af objektivet, ledt gennem to StopLine tyndfilmsnotchfiltre (Semrock, Rochester, NY), et for hver excitationskilde, og transmitteret gennem et apparat med dobbelt visning, der muliggjorde samtidig billeddannelse af Cy3- og Cy5-kanalerne på et enkelt iXon DV 887 EMCCD-kamera (Andor Technology, Belfast, Irland). Alle data blev afbildet med en integrationstid på 0,5 sek. Oversplitning mellem de to kanaler (10 %) forvrænger formodentlig afstandsmålingerne i retning af mindre værdier. Vores eksperimentelle fejl gør den imidlertid uopdagelig, som det fremgår af Monte Carlo-simuleringer, hvor 100 par modellerede billeder af enkelte fluorophorer, der var adskilt med 10 nm, blev skabt og analyseret på samme måde som med DNA-dataene (beskrevet nedenfor). Simulerede billeder af fluorescerende punktspredningsfunktioner blev beregnet ved at generere en integreret 2D Gaussisk intensitetsfordeling med en konstant baggrund, som blev tilsat skudstøj. De simulerede toppe havde de samme dimensioner og signal/støjforhold som de reelle toppe. Simulerede data med 10 % crosstalk og simulerede data uden crosstalk kan ikke skelnes fra hinanden ved en Kolmogorov-Smirnov-test (N 1 = 100, N 2 = 100, p > 0,05).
Dataanalyse. Der blev udført en registreringskortlægning af Cy3- og Cy5-kanalerne med fiducials bestående af 100 nm TransFluoSphere-kugler (Molecular Probes). De blev exciteret ved 532 nm, og de udsender med et bredt emissionsspektrum. Perlen var detekterbar i begge vores kanaler. Vi placerede en enkelt perle i forbindelse med dækglasset, og med vores piezostade steg vi den med nanometerpræcision i et gittermønster (med en afstand på 0,5 μm), idet vi tog et billede ved hvert stop. Slutresultatet var en stak af 312 billeder, der viser perlen i begge kanaler på forskellige positioner (Fig. 1a ).
DNA-dataene blev analyseret ved hjælp af hjemmelavet software med matlab (Mathworks, Natick, MA). Rutinen lokaliserer automatisk toppe i billedet ved at bestemme de pixels med høj intensitet og sikrer, at de omkringliggende pixels har intensiteter som forventet for en enkelt fluorofore. Før vi tilpasser toppene til en 2D Gaussian-funktion for at få dens centerplaceringer, søger vi efter par af toppe. De pixels, der findes i Cy5-kanalen, afbildes på Cy3-kanalen, og der søges efter toppe i de omgivende Cy3-pixels. Hvis der findes en top, betragtes Cy5-toppen og Cy3-toppen som et par med henblik på yderligere analyse. Hver top tilpasses til en 2D Gaussian-funktion i sit respektive rum som beskrevet for perlerne ovenfor (Eq. 1 ). Fejlen i forhold til den tilpassede middelplacering beregnes med antallet af indsamlede fotoner (Nγ), 
Cy5’s placering kortlægges til Cy3-kanalen, og afstanden mellem dem beregnes. Efter den beregningsmæssige analyse af DNA-dataene blev de identificerede fluorforpar screenet manuelt for at sikre, at parrene ikke lå tæt på andre fluorforer, som ville have forstyrret paranalysen.
Myosin V-dataene blev analyseret ved først at identificere en bevægelig motor ved hjælp af øjet. Hjemmelavet software skrevet i matlab tilpassede derefter startparret af fluorescenspidser til 2D Gauss-funktioner som beskrevet ovenfor og fortsatte med at spore spidserne så længe, som brugeren angav. Motorer, hvis konjugerede farvestoffer hver især fotoblegede i et enkelt trin, blev analyseret, hvilket var tilfældet for de fleste af de observerede motorer, hvilket sikrede, at vi faktisk undersøgte motorer med kun én Cy3-mærkning og én Cy5-mærkning. De resulterende baner blev registreret ved at mappe Cy5-banen på Cy3-kanalen. En lineær tilpasning ved hjælp af mindste kvadraters lineære tilpasning af punkterne fra begge baner gav orienteringen af det aktinfilament, som banerne blev projiceret til. Afstande langs den lineære tilpasning (aktinfilamentet) blev plottet mod tiden for at se hovedernes relative afstande (fig. 4).
Tidsspor af et differentielt mærket myosin V-molekyle, der går langs et aktinfilament. Mærkerne (Cy3 og Cy5) er kovalent knyttet til calmoduliner, der er blevet udskiftet på myosin V-molekylet. I dette spor tager begge de fluorescerende sonders placering 72 nm skridt, hvilket indikerer, at calmodulinerne blev udskiftet tæt på motordomænet. De skiftende positioner af sonderne giver en direkte observation af myosin V’s hånd-over-hånd-gangmekanisme.