Materials and Methods
Duplex DNS előállítása. A 30 bp duplex DNS-molekulák előállításához két oligonukleotidot hibridizáltunk a következő szekvenciával és módosításokkal (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Az 5′-GGGTATGGAGAGATTTTTAGCGGAGTGACAGC-3′ oligonukleotidot az 5′ végén Cy5-tel, a 3′ végén Cy3-mal jelöltük. A komplementer oligonukleotidot mindkét végén biotinnal jelöltük.
A fehérje expressziója és tisztítása. A p2Bac/pFastBac-YFP-M5-CaM plazmidban (H. Lee Sweeney (University of Pennsylvania, Philadelphia) ajándéka) a sárga fluoreszcens fehérje (YFP) génjét PCR segítségével töröltük. Az így kapott p2Bac/pFastBac-M5-CaM plazmid a Glu-1099-nél csonka csirke myozin V-t kódolja. A natív tekercset egy leucin cipzár követte a dimerizáció biztosítása érdekében. A tisztítás megkönnyítése érdekében a miozin V fehérjét N-terminálisan FLAG-taggal (DYKDDDDK) jelöltük. Két rekombináns baculovírust hoztunk létre a fehérje Sf9 sejtekben történő expressziójához. Az egyik a csonka miozin V-t és a p2Bac/pFastBac-M5-CaM plazmidból származó Drosophila melanogaster kalmodulint kódolta. A második vírus a p2Bac/pFastBac-ELC plazmidból származó humán esszenciális könnyű láncot kódolta. Mindkét vírust Sf9 sejtek koinfekciójára használtuk. A fehérjét a Sweeney és munkatársai (20) által leírtak szerint expresszáltuk és tisztítottuk.
Kalmodulin jelölés és csere. A kalmodulint expresszáltuk és Cy3-mal vagy Cy5-tel jelöltük az alábbiak szerint: Egyetlen ciszteint vezettünk be a tengeri sün kalmodulinjába a Q143C mutációval. Ezt a kalmodulint Escherichia coliban expresszáltuk és tisztítottuk a 21. hivatkozásban leírtak szerint. A kalmodulint Cy3-maleimid vagy Cy5-maleimid (Amersham Biosciences) törzsoldatokkal (DMSO-ban) jelöltük 1,4-szeres moláris arányban 20 percig. A felesleges festékanyagot gélszűréssel távolítottuk el cserepufferbe (lásd alább), majd egy éjszakán át hidrofób abszorpciót végeztünk BioBeads (Bio-Rad) gyöngyökön. A jelölés beépülése a Cy3-kalmodulin esetében 102%, a Cy5-kalmodulin esetében 75% volt. Az aliquotokat -80°C-on tároltuk.
A jelölt kalmodulin myosin V-re történő cseréjét a leírtak szerint, de néhány módosítással végeztük (22). A miozin V-t (150 nM) 0,7 nM Cy3-jelölt kalmodulinnal és 0,8 nM Cy5-jelölt kalmodulinnal inkubáltuk 22°C-on 2 percig cseréppufferben (25 mM KCl/20 mM imidazol HCl, pH 7,4/2 mM MgCl2/1 mM EGTA) 22°C-on. A kalmodulinok cseréjéhez 0,9 mM CaCl2-t adtunk, és az elegyet 5 percig 22°C-on inkubáltuk. A reakciót 7 mM EGTA-val oltottuk. A reakcióelegyet egy 100K MWCO Nanocep ultraszűrő berendezésre (Pall) vittük fel, és háromszor mostuk azonos mennyiségű AB-vel (lásd alább), hogy a miozin V-t megtisztítsuk a felesleges kalmodulintól.
Áramlási cella előkészítése. Az áramlási cellát egy üveg mikroszkópos tárgylemezből és NLAF21-ből (VA Optical Labs, San Anselmo, CA) készült, erősen fénytörő fedőlemezekből építettük fel, amelyeket kétoldalas Scotch szalagdarabok tartottak össze.
A miozin V kísérletekhez 15 μl biotin-BSA-t (1 mg-ml-1) inkubáltunk az áramlási cellában 2 percig, majd 30 μl AB puffert (25 mM KCl/25 mM imidazol HCl, pH 7,4/1 mM EGTA/4 mM MgCl2/10 mM DTT/1 mg-ml-1 BSA) engedtünk át az áramlási cellán, hogy kimossuk azt. Tizenöt mikroliter 0,5 mg/ml NeutrAvidint (Molecular Probes) adtunk a cellához, és hagytuk inkubálni 2 percig, majd újabb mosást végeztünk AB pufferrel. Az áramlási cellát 15 μl biotinilált falloidin aktin filamentummal (250 nM) inkubáltuk 5 percig, majd 100 μl AB pufferrel történő mosás következett. Végül a sejtet 20 μl képalkotó pufferrel töltöttük fel, amely kalmodulin-cserélt miozin V-t, 5 μM kalmodulint, 300 nM ATP-t, ATP-regeneráló rendszert (0,1 mg-ml-1 kreatin-foszfokináz/1 mM kreatin-foszfát) és 0,5% (vol/vol) Triton-X 100-at tartalmazott a nem specifikus kötődés csökkentése érdekében. A sejtet vákuumzsírral lezártuk és azonnal leképeztük. A végső motorkoncentráció ritkán díszített aktint eredményezett, és így lehetővé tette az egyes miozin V molekulák elemzését.
A DNS-kísérletekhez a biotin-BSA-t és a NeutrAvidint ugyanúgy töltöttük fel, mint a miozin V-kísérletekhez, de a mosásokat T50 pufferrel (10 mM Tris, pH 8,0/50 mM NaCl) végeztük. Miután az áramlási cella NeutrAvidin bevonatot kapott, 15 μlof dsDNS-t (30 nM) T50 pufferben 1 mg-ml-1 BSA-val áramoltattunk be, és 2 percig inkubáltuk, majd 100 μl képalkotó puffert áramoltattunk be. Az áramlási cellát ezután vákuumzsírral lezártuk, és azonnal leképeztük. A DNS-molekulák így kialakult díszítése a felületen kellően ritka volt ahhoz, hogy a különböző molekulákból származó fluoreszcens foltok ritkán fedték egymást.
Mikroszkópos beállítás. A teljes belső reflexiós fluoreszcencia (TIRF) mikroszkópot a ref. 8-ban leírtak szerint, néhány módosítással (5. ábra, amely támogató információként a PNAS honlapján olvasható). Az 532 nm-es (Coherent, Santa Clara, CA) és 633 nm-es (JDS Uniphase, San Jose, CA) gerjesztő forrássugarakat egy dichroikus tükörrel egyesítettük és 7 mm átmérőjűre tágítottuk. Ezeket a forrásokat (fókusztávolság = 500 mm) egy Olympus 1,65 NA ×100 TIRF objektív hátsó fókuszsíkjára fókuszáltuk egy lineáris DeepL transzláción lévő lézervonal-dikroic segítségével, amely lehetővé teszi a mikroszkóp epifluoreszcencia vagy TIRF üzemmódban történő működését. Az objektívet egy zárt hurkú, kéttengelyes, piezo nanoDeepL transzlációs rendszer alatt pozícionáltuk, amely a pozícióméréshez kapacitív érzékelőkkel volt felszerelve (Physik Instrumente, Auburn, MA). Az objektív hátsó nyílásán kilépő visszavert fényt egy kvadráns fotodiódára irányítottuk, hogy jelet szolgáltasson egy fókusz-visszacsatolási hurok számára, amely az objektív és a minta közötti távolságot egy elektrostriktív működtetővel (Newport, Fountain Valley, CA) rögzítette. A fluoreszcencia emissziót az objektív összegyűjtötte, két StopLine vékonyfilmes rovátkaszűrőn (Semrock, Rochester, NY) keresztülvezette, egyet-egyet minden gerjesztő forráshoz, és egy kettős nézetű berendezésen keresztül továbbította, amely lehetővé tette a Cy3 és Cy5 csatornák egyidejű képalkotását egyetlen iXon DV 887 EMCCD kamerán (Andor Technology, Belfast, Írország). Minden adatot 0,5 másodperces integrációs idővel képeztünk le. A két csatorna közötti áthallás (10%) feltehetően kisebb értékek felé torzítja a távolságméréseket. Kísérleti hibánk azonban kimutathatatlanná teszi azt, amint azt Monte Carlo-szimulációk is mutatják, amelyekben 100 pár modellezett képet készítettünk egyetlen, 10 nm-rel elválasztott fluorofórról, és ugyanúgy elemeztük, mint a DNS-adatok esetében (lásd alább). A fluoreszcens pontterjedési függvények szimulált képeit úgy számították ki, hogy egy integrált 2D Gauss-féle intenzitáseloszlást generáltak állandó háttérrel, amelyhez lövési zajt adtak hozzá. A szimulált csúcsok mérete és jel-zaj aránya megegyezett a valós csúcsokéval. A 10%-os keresztbeszűrődéssel szimulált adatok és a keresztbeszűrődés nélküli szimulált adatok Kolmogorov-Smirnov teszt alapján nem különböztethetők meg (N 1 = 100, N 2 = 100, p > 0,05).
Adatelemzés. A Cy3 és Cy5 csatornák regisztrációs leképezését 100 nm-es TransFluoSphere gyöngyökből (Molecular Probes) álló fiducialsokkal végeztük. Ezeket 532 nm-en gerjesztettük, és széles emissziós spektrummal emittálnak. A gyöngy mindkét csatornánkon detektálható volt. A fedőlaphoz kapcsolódóan egyetlen gyöngyöt helyeztünk el, és piezoállványunkkal nanométeres pontossággal léptettük rácsmintázatban (0,5μm-es távolsággal), minden megállásnál képet készítve. A végeredmény egy 312 képből álló halom lett, amely a gyöngyöt mindkét csatornában különböző pozíciókban mutatja (1a. ábra ).
A DNS-adatokat házi készítésű szoftverrel elemeztük matlab (Mathworks, Natick, MA) segítségével. A rutin automatikusan lokalizálja a csúcsokat a képen a nagy intenzitású pixelek meghatározásával, és biztosítja, hogy a környező pixelek intenzitása megfeleljen az egyetlen fluorofór esetében elvárt intenzitásnak. Mielőtt a csúcsokat egy 2D Gauss-függvényhez illesztjük, hogy megkapjuk a középpontok helyét, csúcspárokat keresünk. A Cy5 csatornában talált pixeleket leképezzük a Cy3 csatornára, és a környező Cy3 pixelekben csúcsokat keresünk. Ha csúcsot találunk, akkor a Cy5 csúcsot és a Cy3 csúcsot a további elemzéshez párnak tekintjük. Minden csúcsot egy 2D Gauss-függvényhez illesztünk a megfelelő térben a gyöngyök esetében fent leírtak szerint (1. egyenlet). Az illesztés átlagos helyének hibáját a begyűjtött fotonok számával (Nγ) számoljuk ki, 
A Cy5 helyét leképezzük a Cy3 csatornára, és kiszámítjuk a köztük lévő távolságot. A DNS-adatok számítógépes elemzése után az azonosított fluorofórpárokat manuálisan átvizsgáltuk, hogy megbizonyosodjunk arról, hogy a párok nem állnak más fluorofórpárok közelében, amelyek interferáltak volna a párok elemzésében.
A miozin V-adatokat úgy elemeztük, hogy először szemmel azonosítottuk a mozgó motort. A matlabban írt házi szoftver ezután a kiinduló fluoreszcens csúcspárokat a fent leírtak szerint 2D Gauss-függvényekhez illesztette, és a csúcsok követését a felhasználó által megadott ideig folytatta. Azokat a motorokat elemeztük, amelyeknek a konjugált festékanyagai mindegyike egyetlen lépésben fotoblokkolt, ahogyan ez a legtöbb megfigyelt motor esetében történt, ami biztosította, hogy valóban csak egy Cy3 és egy Cy5 jelöléssel rendelkező motorokat vizsgáltunk. Az így kapott pályákat a Cy5-ös pálya Cy3-csatornára való leképezésével regisztráltuk. A legkisebb négyzetek lineáris illesztése a két trajektória pontjaira megadta az aktin filamentum orientációját, amelyre a trajektóriákat vetítettük. A lineáris illesztés (az aktin filamentum) mentén mért távolságokat az idő függvényében ábrázoltuk, hogy láthassuk a fejek relatív távolságait (4. ábra).
Az aktin filamentum mentén sétáló, differenciálisan jelölt miozin V molekula időbeli lenyomata. A jelölések (Cy3 és Cy5) kovalensen kapcsolódnak a miozin V molekulára cserélt kalmodulinokhoz. Ezen a nyomvonalon mindkét fluoreszcens szonda helye 72 nm-es lépéseket tesz, ami azt jelzi, hogy a kalmodulinokat a motoros domén közelében cserélték ki. A szondák váltakozó pozíciói közvetlen megfigyelést nyújtanak a miozin V kézről kézre járási mechanizmusáról.