Patogenezis In Vitro
Az oszlopos epitélsejtek zsákutcás sejtek, amelyek egyszerre két szélsőséges pH-t tapasztalnak. Apikálisan erősen lúgos bélnedvben, bazálisan pedig enyhén savas hemolimfában fürdenek. Ezeket a körülményeket nehéz utánozni sejtkultúrában, ami magyarázhatja a primer fertőzésről rendelkezésre álló információk szűkösségét.
A GV-replikációt támogató sejtvonalak ritkák, és jelenleg csak a CpGV-re léteznek. Következésképpen a GV-fertőzés mechanizmusairól alig tudunk többet, mint az ODV-fertőzésről. Még így is tudjuk, hogy a GV nukleokapszid-morfogenezis során a gazdasejt nukleáris membránja szétesik, ami nem zavarja a nukleokapszid-feldolgozást. A nukleáris membrán eltűnése jellegzetes, és az NPV-vel fertőzött gazdasejtekben nem fordul elő.
Számos olyan rovarsejtvonalat hoztak létre, amelyek támogatják az NPV-fertőzést. A legtöbb sejtvonal hernyó petefészkekből vagy embriókból származik. Az AcMNPV több rovarfajból származó sejtvonalakban is képes szaporodni, ami hozzájárul ahhoz, hogy a legjobban tanulmányozott baculovírus. Egy standard egylépcsős növekedési görbén az AcMNPV BV-k jellemzően 12-20 h fertőzés után (hpi), az okklúziók pedig 20-48 hpi után keletkeznek. A legtöbb más NPV szaporodása sejtkultúrában órákkal vagy napokkal tovább tart.
AcMNPV BV 1000-szer fertőzőbb, mint az ODV, elsősorban fúziós fehérjéjének, a GP64-nek a jelenléte miatt. A BV-k a célsejtjeikbe klatrin-mediált endocitózissal jutnak be. A BV nukleokapszidok az endoszómákból felszabadulva mélyen behatolnak a célsejtek citoplazmájába. Ezzel a stratégiával a nukleokapszidok megkerülik a plazmamembrán alatti, esetleg veszélyes környezetet, és közelebb jutnak a sejtmaghoz, mint azt a plazmamembránon történő fúzió lehetővé tenné. A BV fúziós fehérjék által tapasztalt pH-érzékeny konformációs eltolódások szolgálnak a vírusburkolat és az endoszómális membrán közötti fúziós esemény kiváltására.
Az ACMNPV nukleokapszidnak az endoszómából való kiszabadulását azonnal követi az F-aktin kábelekkel való társulása. A kábelképződés átmeneti, és a vírus nukleokapszidok sejtmag felé történő mozgása és sejtmagba való bejutása során következik be. A tranzit során a vírusnukleokapszidok ko-lokalizálódnak az aktinkábel egyik végével, valószínűleg a P78/83-on keresztül, amely egy F-aktinkötő fehérje, amelyről úgy gondolják, hogy a nukleokapszidok alján található. A nukleokapszidoknak az F-aktinkábelekkel való társulása és a riportergének expressziójának késleltetése az aktin/mjozin funkciót megzavaró gyógyszerek jelenlétében arra utal, hogy a kábelek megkönnyíthetik a nukleokapszidok magba való szállítását, vagy közvetítik a nukleáris pórusokon való áthaladásukat.
Az NPV és néhány GV nukleokapszid a nukleáris pórusokon keresztül jut be a sejtmagba. Egyes GV-k a nukleáris pórusokon keresztül fejtenek le, de a legtöbb baculovírus lefejtése a sejtmagon belül történik. A korai génátírás azonnal megkezdődik, a gazdaszervezet RNS-polimeráz II (Pol II) közvetítésével. A korai gének között expresszálódik egy olyan alcsoport, amelynek expressziója hatékony G-aktin-transzportot eredményez a sejtmagba és felhalmozódást a sejtmagban (5. ábra). Az aktin lokalizációnak ez a látványos manipulációja kritikus az NPV utódok előállításához, és ezt még egyetlen más kórokozó esetében sem írták le. Az aktin nukleáris lokalizációjában részt vevő, tranziens transzfekciós kísérletekben azonosított gének közé tartozik az ie1, pe38, Ac004, Ac152, he65 és Ac102. A gének közül kettő, az ie1 és az Ac102 konzerválódik az összes lepidoptera NPV és GV között, és mindkettő esszenciális.
5. ábra. Nukleáris G-aktin az AcMNPV-vel fertőzött sejtekben. (a) 4′,6-diamidino-2-fenilindollal (DAPI) festett fertőzött sejtek; (b) transzfektált zöld fluoreszcens fehérjét (GFP)-aktint expresszáló fertőzött sejt. (c) A nukleáris rodamin-falloidin festődés hiánya azt jelzi, hogy a nukleáris aktin monomer.
A fertőzés késői stádiumába való átmenet a BV utódtermelés időszakának kezdete; a sejtek tevékenysége a víruskomponensek maximális sebességgel történő szintézisére, nukleokapszid termékekké való összeépítésére, majd exportálására irányul. A gazdaszervezet makromolekuláris szintézise ebben az időszakban leáll, de a gazdaszervezet kromatinszerkezete a sejthalálig érintetlen marad. A késői és nagyon késői vírusgéneket a vírus által kódolt RNS-polimeráz fejezi ki.
A fertőzés korai fázisában újrarendeződött mikrotubulusokat a késői fázisban termelődő faktorok depolimerizálják, ami a sejt lekerekítéséhez vezet (6. ábra). Hasonlóképpen, a korai fázisban a sejtmagban felhalmozódott G-aktin a késői fázisban polimerizálódik, a sejtmag duzzadásával és a látható gazdaszervezeti magstruktúrák eltűnésével egyidejűleg (7. ábra). A virogén stróma, a vírus DNS-szintézisének helye, a sejtmag közepén alakul ki, és egy “gyűrűs zónának” nevezett elektronfényes zóna határolja és veszi körül, ahol a genom betöltése során a kapszidok összeállnak és rögzülnek. A nukleáris F-aktin ko-lokalizálódik a fő AcMNPV kapszidfehérjével a gyűrűs zónában (7. ábra).
6. ábra. AcMNPV-vel fertőzött Sf21 sejtek, amelyek a citopátiás hatás (CPE) különböző fázisait mutatják. (a) Nem fertőzött sejtek. Figyeljük meg az orsó alakját és a nukleokromatin struktúrák jelenlétét. (b) AcMNPV-vel fertőzött sejtek, amelyek korai és késői CPE-t mutatnak. A sejtek a depolimerizálódó mikrotubulusok miatt lekerekítettek, a sejtmagok nagyobbak és megtisztultak a gazdaszervezet struktúráitól, és a virogenikus strómát (vs) gyűrűs zóna (rz) veszi körül. A virogén stróma a fertőzés késői szakaszának előrehaladtával sűrűbbé válik. A fertőzés nagyon késői szakaszában (p) poliéderek töltik ki a sejtmagot.
7. ábra. Nukleáris F-aktin az AcMNPV-vel fertőzött sejtben a késői génexpresszió során. (a) A DAPI-festés jelzi a sejtmag elhelyezkedését. (b) A zöld fluoreszcencia jelzi, hogy a kapszidfehérje elsősorban a sejtmag gyűrűs zónájában lokalizálódik. (c) A rodamin-falloidin festés azt mutatja, hogy az F-aktin ko-lokalizálódik a kapsziddal a gyűrűs zónában.
A nukleáris F-aktin szükséges a BV-termeléshez. Az F-aktint megzavaró gyógyszerek jelenlétében a víruskapszidok eldeformálódnak, és a belső magmembránnal szomszédos hosszú csőszerű struktúrákként jelennek meg, ritkán elektrondenzitású foltokkal. A normális esetben jelenlévő alaplemezek és kupakszerkezetek nem láthatók, és többlet membránprofilok keletkeznek. A vírusos DNS-szintézis a normális ütemben zajlik, de a genomok nem csomagolódnak, és a virogén stróma a normális strómához képest “laza” megjelenésű. Érdekes módon az AcMNPV nagyon késői faktor-1 (VLF-1) hiánya esetén a fenotípus hasonló, ami arra utal, hogy a VLF-1 részt vehet a kapszidok virogén strómához való rögzítésében, és hogy az F-aktin a stróma egyik összetevője, amelyhez a kapszidok közvetlenül vagy közvetve kapcsolódnak.
A P78/83, egy kisebb kapszidfehérje, amely a fertőzés során későn expresszálódik, elengedhetetlen az AcMNPV életképességéhez. Ezt a tulajdonságot több mint 30 évvel ezelőtt figyelték meg és használták ki az első kereskedelmi baculovírus expressziós készletekben. A P78/83 (78 kDa, ha nem foszforilált, és 83 kDa, ha foszforilált) feltételezhetően mind a BV, mind az ODV kapszidok alaplemezének része. A P78/83 egy F-aktinhoz kötődő fehérje, és ez az aktivitás segíthet a kapszidokat a nukleáris mátrixhoz rögzíteni az összeszerelés során. Érdekes módon a P78/83 tartalmaz egy másik aktivitást is, amely megmagyarázza, hogy miért nélkülözhetetlen; elősegíti az aktin polimerizációt a sejtmagon belül. A P78/83 olyan doméneket tartalmaz, amelyek konzerválódtak a Wiskott-Aldrich-szindrómás fehérje (WASP) család tagjaiban, az aktin filamentumok nukleációját elősegítő faktorokban. A WASP család tagjai pozitívan szabályozzák az aktin rokon fehérje (Arp)-2/3 komplex aktin nukleáló aktivitását. Az eukariótákban konzervált, hét alegységből álló komplex az AcMNPV-vel fertőzött sejtekben transzlokálódik a sejtmagba, és a P78/83 aktiválja. A P78/83 mutációi, amelyek az aktin nukleáció elősegítésének csökkent képességéhez vezetnek, ennek megfelelően a fertőző BV előállításának csökkent képességéhez vezetnek.
Az AcMNPV DNS közvetlenül a sejtmagba való belépést követően nukleoszóma-szerű szerkezetet vesz fel, és nukleoszómákat és nukleoszómával kapcsolatos folyamatokat használ a genom replikációjában. A vírus replikációs stratégiájának egyik összetevője tehát úgy tűnik, hogy eltéríti a gazdaszervezet kromatin-remodellező képességének komponenseit, ha nem is teljes egészét. A legújabb bizonyítékok szerint a BRO (baculovirus repeated orf) fehérjecsalád valószínűleg részt vesz ebben a folyamatban. A BRO fehérjék a fertőzés korai szakaszában expresszálódnak, kötődnek az egyszálú DNS-hez (ssDNS) és a maghisztonokhoz, és frakcionálási kísérletekben a hisztonokkal osztódnak. A BmNPV, az orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus és a lymantria dispar multiple nucleopolyhedrovirus mind több bro génnel rendelkezik. Az AcMNPV csak egy bro gént hordoz, amely a BmNPV bro-d génjével rokon, és amely esszenciális.
Az AcMNPV által kódolt P6.9, a rendkívül bázikus genomcsomagoló fehérje a fertőzés késői szakaszában kezd felhalmozódni, és egy alternatív kromatinszerkezet alakul ki.
A P6.9-DNS kölcsönhatásokat a P6.9 foszforilációs állapota szabályozza. A genomcsomagolás során a virogenikus stróma genomiális DNS-e a P6.9-hez kötődik, mivel a P6.9 defoszforilálódik, és egy kúpos végszerkezetben lévő nyíláson keresztül egy előre kialakított kapszidhüvelybe kondenzálódik. A kúp alakú struktúrák a virogén stróma proximális részén helyezkednek el, a kapszidhüvelyeket bázislemezek fedik, amelyek distalisan egy kevésbé elektronsűrű térbe, a gyűrűs zónába nyúlnak. Az F-aktin és a kapszidfehérje, valamint a P78/83 és az Arp2/3 komplex együtt lokalizálódik a gyűrűs zónában. A replikációnak ezt a szakaszát befolyásolják mind az F-aktint megzavaró gyógyszerek, mind a VLF-1 hiánya.
A fertőzés nagyon késői fázisának kezdetével csökken a BV-termelés és megindul az ODV-termelés. Az újonnan összeállított nukleokapszidok a sejtmagban maradnak, ahol a belső magmembránból származónak vélt burokba csomagolódnak. A burkolt virionok, de a burkolatlan nukleokapszidok nem, fehérjemátrixba záródnak, és kapszulákat vagy poliédereket alkotnak. A sejtek végül lizálódnak, és az okklúziókat a közegbe engedik.