Transzkripció
A transzkripció a genetikai információ átvitele a DNS-ről az RNS-re, a DNS mint sablon felhasználásával. A fehérjeszintézis a riboszómákban történik.
Mi a gén? Egy szinten a gén nukleotidok rendezett sorozata, amely egy polipeptidet kódol. Az ilyen gének “szerkezeti” gének. Azt is tudjuk,hogy a gének kódolhatnak RNS-t is, beleértve a hírvivő RNS-t (mRNS), a transzfer RNS-t (tRNS),a riboszomális RNS-t (rRNS), valamint más RNS-típusokat. De valaminek be kell kapcsolniaés le kell állítania a génexpressziót, valamint szabályoznia kell azt. A szabályozó szekvenciák,amelyek lehetnek “promóterek” vagy “enhancer/silencerek”, a kódoló régióktól távol helyezkedhetnek el. Tehát a génről alkotott képünknek most már magában kell foglalnia a kromoszóma különálló régióinak gondolatát is. Mi van akkor, ha az mRNS-re felírt információ nem tükrözi a végleges fehérjét, amíg azt tovább nem módosítják? Ez a “poszttranszkripcionális módosítás”. Most a gén fogalma még homályosabbá válik. Mi van, ha vannak “átfedő” kódoló régiók? Nyilvánvaló, hogy a gén definíciója nem lesz egyszerű.
Funkcionálisan azonban úgy írhatjuk le a gént, hogy van egy külön kódoló régiója és egy külön szabályozó régiója, ez utóbbi szabályozza a DNS mRNS-é történő átíródásának sebességét. Látni fogjuk, hogy a szabályozó egységek DNS “motívumokból” állnak, és hogy minden motívumot egy szabályozó fehérjének kell elfoglalnia, ha egy gént megfelelően akarunk szabályozni. Nemcsak a fehérjéknek kell megfelelő módon kapcsolódniuk, hanem a fehérjéknek össze kell illeszkedniük más, közeli motívumokhoz kötődő fehérjékkel, ahogyan a kirakós játék darabjai illeszkednek egymáshoz. És csak egyetlen helyes módja van annak, hogy minden összeilleszkedjen. Tehát nem csupán arról van szó, hogy a DNS irányítja azmRNS-szintézist, amely aztán a fehérjeszintézist irányítja; a fehérjék eredendően részt vesznek a fehérjetermelés szabályozásában a transzkripció szintjén.Ez rémálommá válhat, ha a szabályozó fehérjék termelésének szabályozására kezdünk gondolni.
Az eukarióták és a prokarióták közötti fontos különbséget is figyelembe kell vennünk a strukturális vagy fehérjekódoló gének átírása tekintetében. Az eukariótákban a géneket külön-külön írják át, míg a prokariótákban a rokon funkciójú gének (“operonok”) együttesen is átíródhatnak. A Lac operon például három fehérjekódoló gént, valamint azok vezérlő szekvenciáit tartalmazza. Az operon egyetlen egységként, “policisztronikus mRNS”-ként íródik át. Az eukarióta strukturális gének monocisztronikus mRNS-ként íródnak át.
DNS-irányított RNS-szintézis
A DNS-irányított RNS-szintézist három lépés jellemzi:
(1) Indítás a transzkripciós apparátusnak a DNS-templáthoz való kötődésével
(2) Az mRNS-lánc megnyúlása
(3) Az mRNS-lánc befejezése
A “gént” kódoló DNS közvetlen átírásából származó mRNS-darabot “elsődleges átirat”-nak nevezzük, és néha igen kiterjedt módosításon megy keresztül, mielőtt üzenetét fehérjévé fordítaná.
Az RNS-t szintetizáló enzimek osztályát RNS-polimerázoknak nevezik. Ezek mind több alegységből álló komplexek, amelyek minden sejtben jelen vannak, és katalizálják a reakciót:
(RNS)n maradék + 1 NTP === (RNS)n+1 maradék + PPi
A pirofoszfát irreverzibilisen hidrolizálódik 2 Pi-re, így hajtva a reakciót jobbra. A DNS mintaszálról leolvasott egyes nukleotidok átíródnak a megfelelő RNS nukleotidjaivá, így a végeredmény egy egyszálú polimer, azaz az mRNS, amelynek nukleotidjai pontosan megfelelnek a DNS-szál komplementer nukleotidjainak, azzal a különbséggel, hogy ahol a DNS mintaszálon egy “A” jelenik meg, ott az mRNS-ben egy “U” jelenik meg. (A lehetségesNTP-k tehát az ATP,CTP,GTP,UTP.)
Transzkripció a prokariótákban
A legtöbbet tanulmányozott RNS-polimeráz az E.coliból származó, ezért azt fogjuk tanulmányozni, mint az RNS-polimerázok prototípusát. A holoenzim egy 449 kD fehérje,amely egy “magenzimből” és egy “s-alegységből” áll,és a teljes komplexet (mag)s-nek nevezzük. A core enzim irányítja a polimerizációs reakciót, és 4 alegységből áll: core enzim = a2bb’w. A szervetlen ionok Zn2+ (kettő a b’alegységben) és Mg2+ szükségesek a katalitikus aktivitáshoz, és az enzim háromdimenziós szerkezete egy kézre hasonlít. A kéz hüvelykujja úgy képzelhető el, mint amely megragad egy darab B DNS-t, amely a kéz ívelt ujjai és tenyere által képviselt csatornában fekszik. Ez a csatorna cilindrikus, méretei 25 A x 55 A nagyságrendűek. Ezek a méretek lehetővé teszik a B DNS körülbelül 16 bázispárjának befogadását.
A “kéz” szerkezete más enzimekben is megjelenik, amelyeket tanulmányozni fogunk, beleértve a DNS-polimerázt és a reverz transzkriptázt. Az RNS-polimeráz kézszerkezetét tovább tanulmányozhatjuk a T7 RNS-polimerázzal (lásd a PDB-t alább).
1ARO: T7 RNS-polimeráz
Az átírást a gén szemszögéből fogjuk megvizsgálni, amelyről már említettük, hogy meglehetősen kétértelmű entitás. Mindazonáltal világos, hogy a helyes átíráshoz kell lennie egy kiindulópontnak, és ésszerű ezt a gén részének tekinteni, még akkor is, ha maga nem íródik át. Tehát a beindítás problémája valójában a kiindulópont felismerése. De vajon a DNS két szála közül melyik szolgál templátként, és hogyan választja ki a polimeráz?
Mindkét szál szolgálhat templátként, de az átírás mindig a DNS-szál 5′ végétől halad a 3′ végéig. A templátként szolgáló 3′-5′ szálat nevezzük “antisense” vagy nem kódoló szálnak, az5′-3′ szálat pedig (amely a “T”-t helyettesítő “U”-k kivételével ugyanazzal a nukleotidszekvenciával rendelkezik, mint a később átírt mRNS) “sense” vagy “kódoló” szálnak. A következetesség és az egyértelműség érdekében azt a konvenciót fogjuk használni, hogy a nukleotidok szekvenciája mentén a pozíció leírása a sense szál szemszögéből történik, mivel ez ugyanaz a sorrend, mint az átírt mRNS sorrendje. A génnek azt a részét, amely az iniciációs helyként szolgál, “promóter”-nek nevezzük, és az RNS-polimeráz holoenzim keresi fel. A holoenzim gyengén kötődik a DNS-hez, Kdissoc értéke körülbelül 10-7 M, és ez lehetővé teszi, hogy a promótert keresve az antiszenz szál mentén mozogjon. Az ss-alegység specifikus a promóter szekvenciájára, és a holoenzim szoros kötődése következik be (Kdissoc körülbelül 10-14 M).
A promótert egy körülbelül 40 bp hosszúságú nukleotidszekvencia ismeri fel az iniciációs hely 5′ oldalán, és ezen a szekvencián belül két “konzervált” szekvencia található. Ezek közül az egyik 6 bp hosszú, és a transzkripció kezdőhelyétől kb. 10 bps-mal feljebb helyezkedik el. Ez a “Pribnow Box”, és konszenzus szekvenciája TATAAT.A másik, kevésbé konzervált szekvencia kb. 35 bp-nyira van a folyásiránytól felfelé, és konszenzus szekvenciája TTGACA.A starthelyet a +1 jelölés jelöli, és szinte mindig A vagy G. Az indítóhelyet a +1 jelölés jelöli, és szinte mindig A vagy G.
Az RNS-polimeráz holoenzim nagyjából a két régió (-10 és -35) középpontjában érintkezik a promóterrel, és a magenzim szorosan kötődik a duplex DNS-hez.Hatása a kettős szálú DNS megolvasztása egy kb. 11 bps hosszúságú szekvencia mentén, -9-től +2-ig. Az s faktor leválik, ahogy a transzkripció megkezdődik.
A sejtben lévő specifikus s faktorok határozzák meg, hogy mely gének fognak átíródni. Így az egyes sejttípusokat az s faktorok jellemzik.
A láncnyúlás az 5′–> 3′ irányban halad, és a “transzkripciós buborék” (az “olvadt” DNS hossza) az RNS-polimerázzal együtt halad. Ennek következtében az olvasztatlan DNS a buborék előtt túlcsévélődik, a buborék mögött pedig alulcsévélődik. A topoizomerázok ezután a pozitív és negatív szupertekercseket lazítják. A keletkező mRNS egy rövid ideig a DNS-hez hibridizálódik a downstream pozícióban, és a DNS-től elkülönülve, “farokként” létezik, a kapcsolódási pont a downstream végén van. Az RNS-polimeráz nem esik le a DNS-ről a feldolgozás során, mivel viszonylag szorosan, de nem specifikusan kötődik a transzkripciós buborék mindkét oldalán, amit a DNS köré tekeredő “hüvelykujja” stabilizál. Körülbelül 20-50 nukleotidot ír át másodpercenként 37 C-on, és egy nukleotid körülbelül minden 104. alkalommal hibásan íródik át. Mivel a géneket ismételten átírják, ez a hibaarány nem túl káros, különösen, ha azzal a ténnyel párosul, hogy minden egyes aminosavra több kodon (“szinonimák”) van, és hogy a fehérjében lévő egyetlen aminosav cseréjének hibája általában nem akadályozza a fehérje működését.
A génátírás spontán befejezését “terminációs szekvenciák” jelzik.Az E.coli-ban az átírás leállításának végső jele a 4-10 A-T bázispárból álló sorozat, amely a sablonszálon lévő Asszal áll le. Ebben a régióban minden egyes A után az mRNS-átirat egy U-t tartalmaz.Közvetlenül e szekvencia előtt található egy Gand C bázisokban gazdag régió, amelyet egy nukleotidokból álló spacer és egy másik G és C bázisokban gazdag régió követ. A két G,Crich régió olyan, hogy az egyik régió 180o -os aszimmetriaművelettel a másik fölé helyezhető. A bázispároknak ezt a forgásszimmetriás középpont körüli kapcsolatát “palindromos szekvenciának” nevezzük. Az mRNS 3′ végén a nukleotidok eredő sora olyan, hogy hajszálhurok alakulhat ki, a Gs bázispár a Cs-sel és fordítva, az As pedig az Us-szal. A 3′ vég legvégső része egy Us-sorozat, amelyet egy hidroxilcsoport követ.Miközben a hurok kialakul, az RNS-polimeráz szünetet tart a terminációs helyen. Avégső oligo-U farok, amely csak gyengén kötődik a DNS templát szálhoz, kiszorul a nem templát DNS szálból.Most az mRNS szál szabad a DNS templátból. A termináció teljes folyamatát azonban számos egyéb tényező is befolyásolja.
A transzkripció nem spontán terminációjához egy “rho faktor”-fehérje szükséges, amely szintén a spontán termináció hatékonyságának javításában játszik szerepet.A rho faktor felismer egy szekvenciát a növekvő mRNS-láncon, a terminációs helytől felfelé, majd csatlakozik és a lánc mentén halad az5′-3′ irányban, amíg el nem éri a terminációs helyen szünetelő RNS-polimerázt. A transzkript a rho faktor által az RNS-DNS duplexnek a rho faktor által történő letekercselésével válik le a sablonszálról.
Transzkripció az eukariótákban:
Míg nagyon hasonló a prokariótákéhoz, az eukariótákban a transzkripció “gépezete” és az ellenőrző szekvenciák sokkal összetettebbek, és számos RNS-polimeráz létezik.
A riboszómális RNS (rRNS) az összes RNS mintegy 95%-át és a riboszómákban lévőRNS mintegy 67%-át teszi ki. Az RNS fennmaradó része tartalmazza a transzferRNS-t (tRNS), a hírvivőRNS-t (mRNS) és más, kisebb mennyiségben jelenlévő típusokat, mint például az mRNS-splicingben részt vevő “kismagvas” RNS-eket (snRNS) és az RNS szerkesztésében részt vevő “vezető” RNS-eket. Ez utóbbi két folyamat az eukarióta mRNS életciklusának posztDeepL transzlációja során zajlik. Minden RNS-t a DNS kódol, és az eukarióták RNS-polimerázának különböző típusai ezt tükrözik, valamint azt a tényt, hogy eukariótákban az mRNS DNS-be történő transzlációja a sejtmagon kívül történik.
A legtöbb rRNS előfutárai a sejtmagban szintetizálódnak az RNS-polimeráz I enzim segítségével. Az mRNS prekurzorai a nukleoplazmában szintetizálódnak az RNS-polimeráz II által, míg az RNS-polimeráz III szintén a nukleoplazmában szintetizálja az 5S RNS, a tRNS és más, a sejtmagban és a citoplazmában egyaránt megtalálható RNS prekurzorait. A mitokondriumoknak saját RNS-polimerázaik vannak, és ezek analógok a növényekben található kloroplasztisz RNS-ekkel. Az RNS-polimeráz II-re fogunk összpontosítani, mivel az eukariótákban ez vesz részt a transzkripcióban.
Megnézheti az élesztő RNS-polimeráz II szerkezetét (lásd a PDB-t alább), mivel prototípusként tárgyaljuk a szerkezetét. Ezek nagy, több alegységből álló enzimek, amelyek közül néhány alegység a prokarióta RNS-polimeráz a,b,és b’ alegységeinek homológja.Az enzim általános alakja hasonló a prokarióta RNS-polimerázéhoz ( és a DNS-polimerázéhoz), nevezetesen egy “hüvelykujj”-motívummal rendelkező kézé, amely egy elég nagy csatornát szegélyez, amely egy darab B-DNS-t tartalmaz (körülbelül 25 A széles).
1ENO: Yeast RNA Polymerase II
Az mRNS-lánc megnyúlásának kémiájával még nem foglalkoztunk, de most megtesszük. A láncok 5′–> 3′ irányban a növekvő lánc 3′ OH-csoportjának a beérkező NTP a-foszfátjának nukleofil támadása révén nyúlnak meg.
A prokariótákhoz hasonlóan az eukarióta transzkripció a promotorok felismerésével kezdődik. Az rRNS-szintézist irányító rRNS-géneknek sok másolata van,mind közel azonos szekvenciával. Ez a redundancia biztosítja a megfelelő rRNS-ellátást, amely, mint korábban említettük, a sejtek RNS-ének mintegy 95%-át teszi ki.Ezeknek a majdnem azonos géneknek a promóterei ezért azonosak, így az RNS-polimeráz I-nek csak egy promóterszekvenciát kell felismernie. Az RNS-polimeráz I azonban fajspecifikus (az RNS-poli II és III nem fajspecifikus).
Az emlős rRNS promóteréhez, van egy “core promóterelem”, amely a -31-től +6-ig terjed (megjegyzendő, hogy ez átfedésben van a gén átíródó régiójával) és egy “upstream promóterelem”, amely a -187-től -107-ig terjed.
A gének RNS-polimeráz III által történő átírása esetén a promóter néha a gén átírt részén belül, +40 és +80 között helyezkedik el, de lehet részben vagy teljesen a starthelytől felfelé is.
RNS-polimeráz II promóterek és kontrollszekvenciák
Az RNS-polimeráz II promóterszekvenciái változatosak. Ezeket két osztályba sorolhatjuk: olyan génekre, amelyek minden sejtben nagyjából azonos sebességgel termelnek fehérjéket (“konstitutív enzimek”), és olyan génekre, amelyek termelési sebessége sejttípusonként nagymértékben változik, és a differenciált sejt adott időpontban fennálló igényeitől függ (“indukálható enzimek”).
Konstitutív gén promóter elemek:
A GC doboz : Ez egy olyan régió, amely a GGGCGG szekvencia egy vagy több példányát tartalmazza (vagy annak komplementerét) a starthelytől felfelé, és analóg a prokarióta promóter elemekkel.
Más promóter elemek is megtalálhatók a GC boxtól felfelé a -50 és – 110 közötti régióban.
Szelektíven expresszálódó gén promóter elemek:
A TATA box : A körülbelül -25 és -30 között elhelyezkedő régió, amely az “A” és “T” nukleotidokban gazdag, és amely hasonlít a Pribnow boxhoz (TATAAT). A gének akkor is átíródhatnak, ha a TATA-doboz hibás, és úgy gondolják, hogy a TATA-doboz részt vesz a transzkripció kezdőhelyének kiválasztásában
A CCAAT-doboz : Ez egy olyan szekvencia, amely gyakran a TATA-doboz előtt található, körülbelül -70-90 között. Ezek kötik az RNS-polimeráz II-t, valamint más, a transzkripció beindításához szükséges fehérjéket.
A szerkezeti gének kontrollszekvenciái:
A kromoszóma más, a starthelytől némileg távolabbi régiói is befolyásolhatják az RNS-polimeráz II kötődését a promóterelemekhez. Ezeket a génelemeket “enhancer”-nek és “silencer”-nek nevezik. Az “aktivátoroknak” és “represszoroknak” nevezett fehérjék kötődhetnek az enhancerekhez és a silencerekhez, így befolyásolva a polimeráznak a promóterekhez való kötődését. Továbbá,ugyanaz a fehérje a specifikus kölcsönhatástól függően aktivátorként vagy represszorként is működhet (“kettős hatású” transzkripciós faktorok).
Recruitment of RNA Polymerase II to the Promoter:
Az eukarióták nem rendelkeznek egy egyszerű fehérjével, amely megfelel a prokarióták s-faktorának. Inkább van egy sor fehérje, amelyek együttesen ugyanazt a funkciót látják el, mint az s-faktor, és ezek az “általános transzkripciós faktorok” (“GTF-ek”). A transzkripciós faktorok szerkezetével már foglalkoztunk, amikor egy korábbi előadáson aDNS-fehérje kölcsönhatást tárgyaltuk. Egyébként a transzkripcióindítás általános mechanizmusai hasonlóak.
Az alacsony és változatlan alaptranszkripciós sebességhez 6 GTF szükséges, és ez a sebesség másfehérje-faktorok részvételével növelhető. Ezek a GTF-ek egy “preiniciációs komplexet” alkotnak, amely akkor kezdődik, amikor a “TATA binding protein” (“TBP”) kötődik a promóter TATA dobozához (ha van ilyen). A specifikus szekvencia, amelyhez kötődik, azonosítja a transzkripció kezdőhelyét. E kötődés eredményeként aDNS a TATA-doboz mindkét végén lévő csomókkal torzul. Más GTF-ek szukcesszíven kötődnek, ezt követi az RNS-polimeráz kötődése. Végül a fennmaradóGTF-ek kötődnek.
1YTB: TBP/TATA Box komplex
A TBP (amely a TFIID egyik összetevője) kötődése után a kötődés sorrendje a következő:
TFIIA
TFIIB
TFIIF
RNS PII
TFIIE
TFIIH
TFIIH két fontos enzimaktivitással rendelkezik. Az első egy ATP-függőhelikáz aktivitás, amely segíti a nyitott komplex kialakulását, a második pedig egy kináz aktivitás, amely az RNS-polimeráz II legnagyobb alegységének foszforilációját eredményezi a C-terminális végén. Most már megkezdődhet a transzkripciós elongációs folyamat, a különböző GTF-ek (a TFIIF kivételével) az elongáció során disszociálnak a komplexből. A TFIID a promóterhez kötve marad, így az ismételt transzkripció megtörténhet, miközben a GTF-ek újra összeállnak, hogy a preiniciációs komplexet alkossák.
Ez a tárgyalás az RNS-polimeráz II-re összpontosított; az RNS-polimeráz I és III esetében más transzkripciós faktorokra van szükség. Azonban mindháromnak szüksége van TBP-re.
A sejtek minden gén transzkripcióját külön-külön szabályozzák. A csendesítők és az enhancerek egyedi kombinációja minden gén esetében modulálja a transzkripciós sebességet. Hogyan befolyásolják a promótertől távol kötött aktivátor és represszor fehérjék a gének átírását?
A “Specificity protein 1” (Sp1) volt az első humán transzkripciós faktor, amelyet találtak, amely képes volt felismerni egy specifikus GCregulációs enhancer szekvenciát. Ennek a fehérjének két érdekes modulja van:
(1) Egy 3 cinkujjból álló modul az egyik végén;
(2) Egy modul az ellentétes végén 2 diszkrét, Gln-ben gazdag szegmenssel.
A glutaminban gazdag véget nélkülöző mutánsok képesek kötődni a DNS-hez, de a transzkripció nem stimulálódik. Ezért a glutaminban gazdag végnek valami máshoz kell kötődnie ahhoz, hogy a transzkripció létrejöjjön, és ezek a “koaktivátorok”.Ezeket “TBP-assziciált faktoroknak” vagy “TAF-oknak” is nevezik, és legalább nyolc van belőlük, amelyek fontosak a transzkripció aktiválásában. Ezek nem bazális faktorok (GTF-ek), és nem kötődnek specifikus DNS-szekvenciákhoz. Inkább mohón kötődnek a TBP-hez, és több “dokkolóhelyet” biztosítanak az aktivátorok számára. Ebben az értelemben ők “adaptor molekulák”. Az ilyen adaptor molekulák “eszköztára” óriási változatosságot biztosít az agenek transzkripciójának modulálására. Tehát, kiterjesztve aGTF-ek preiniciációs komplexének a prokarióta s faktorral való korábbi összehasonlítását, jobb összehasonlítás lenne az s faktor és az aktivátor-koaktivátor-alap preiniciációs komplex teljes komplexe között. Ami azt illeti, hogy ez az elrendezés hogyan módosítja vagy befolyásolja a transzkripció sebességét, valószínűleg elsősorban a DNS torzulása közvetíti, amely megkönnyíti az RNS-polimeráz II mozgását a kódoló régió mentén.
Latchman (TRENDS in Biochemical Sciences Vol. 26 No.4 April 2001) rámutatott magának a DNS-kötőhelynek a fontosságára, amely kulcsszerepet játszik a transzkripciós modulációban. Ugyanaz a transzkripciós faktor különböző konformációkat vehet fel, ha különböző helyekhez kötődik. A konformációváltozásokat a DNS-fehérje kölcsönhatás indukálja, ezáltal növelve a transzkripció irányítási spektrumának rugalmasságát, mivel egy fehérje úgy hathat, mint egy egész fehérjekollekció, mindegyiknek saját hatása van (aktiválás, gátlás vagy nincs hatás).
Egy lépéssel továbblépve elképzelhető, hogy hasonló jelenség fordulhat elő, amikor koaktivátorok kötődnek aktivátorokhoz. Talán különböző konformációs változásokat indukálnak hasonlóan a kötött fehérjében a fehérje-fehérje kölcsönhatás típusától függően. Az ilyen konformációs változások aztán a transzkripció modulálásának különböző képességét eredményezhetik.
A transzkripciós faktorok aktiváló doménjei gyakran glutaminban gazdagok, mások viszont prolinban gazdagok vagy savasak. Néhány esetben hidrofób maradékok vannak a savas vagy glutamin maradékok között, és fontosak az aktiváláshoz. Tjian (Cell, Vol. 77, 5-8, 1994. április 8.) feltételezi, hogy a hidrofób erők hajtják az aktiváló domének és a célpontjaik közötti kohéziót, és hogy a specifitást a kohéziós elemek periodicitása biztosítja.
A gének csak akkor íródnak át mérhető sebességgel, ha a megfelelő aktivátorok jelen vannak, és képesek legyőzni a represszorok hatását.
