Material and Methods
Duplex DNA Preparation. 30bpの二重鎖DNA分子を作るために、以下の配列と修飾を持つ2つのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズした（Integrated DNA Technologies, Coralville, IA）。 オリゴヌクレオチド5-GGTATGGAGATTTTTAGCGGAGTGACAGC-3′は、その5′端でCy5で、その3′端でCy3で標識した。 相補的なオリゴヌクレオチドは両端をビオチンで標識した。
タンパク質の発現と精製。 p2Bac／pFastBac-YFP-M5-CaMプラスミド（H. Lee Sweeney, University of Pennsylvania, Philadelphiaからの贈り物）中の黄色蛍光タンパク質（YFP）遺伝子をPCRにより欠失させた。 得られたp2Bac/pFastBac-M5-CaMプラスミドは、Glu-1099で切断された鶏ミオシンVをコードしている。 二量体化を確実にするために、ロイシンジッパーがネイティブコイルドコイルに続いている。 精製を容易にするために、ミオシンVタンパク質はFLAG-タグ（DYKDDDDK）でN末端をタグ付けされた。 Sf9細胞でのタンパク質発現のために、2種類の組換えバキュロウイルスを作製した。 一つは、p2Bac/pFastBac-M5-CaMプラスミドに由来する切断型ミオシンVとDrosophila melanogaster calmodulinをコードしているものである。 第二のウイルスは、p2Bac/pFastBac-ELCプラスミドに由来するヒト必須軽鎖をコードしていた。 両方のウイルスをSf9細胞のコインフェクションに使用した。 このタンパク質は、Sweeneyら（20）により記載されたように発現および精製した。
Calmodulin Labeling and Exchange. カルモジュリンは、以下のように発現させ、Cy3又はCy5で標識した。 突然変異Q143Cにより、ウニカルモジュリンに単一のシステインを導入した。 このカルモジュリンを大腸菌で発現させ、文献21の記載に従って精製した。 このカルモジュリンをCy3-maleimideまたはCy5-maleimide（Amersham Biosciences）ストック溶液（DMSO中）で1.4倍のモル比で20分間標識した。 過剰な色素は、交換バッファー（下記）へのゲルろ過により除去し、その後、BioBeads（Bio-Rad）に一晩疎水性吸着させた。 Cy3-カルモジュリンでは102％、Cy5-カルモジュリンでは75％が標識として取り込まれた。 アリコートを-80℃で保存した。
標識カルモジュリンのミオシンVへの交換は、記載されている通りに行ったが、いくつかの修正を加えた(22)。 ミオシンV（150nM）を0.7nM Cy3標識カルモジュリンおよび0.8nM Cy5標識カルモジュリンと交換緩衝液（25mM KCl/20mM imidazole HCl, pH7.4/2mM MgCl2/1mM EGTA）中22℃で2分インキュベートした。 カルモデュリンを交換するために、0.9 mM CaCl2を加え、22℃で5分間インキュベートした。 反応は7 mM EGTAでクエンチした。 反応混合物を100K MWCO Nanocep限外ろ過装置（Pall）に適用し、等量のAB（下記）で3回洗浄し、過剰なカルモジュリンからミオシンVを精製した
フローセルの調製。 フローセルは、ガラス製顕微鏡スライドとNLAF21（VA Optical Labs, San Anselmo, CA）からなる高屈折カバースリップを両面スコッチテープの断片によってつなぎ合わせて構築した。
ミオシンVの実験では、15μlのビオチン-BSA（1mg-ml-1）をフローセル内で2分間インキュベートした後、30μlのABバッファ（25 mM KCl/25 mM imidazole HCl, pH 7.4/1 mM EGTA/4 mM MgCl2/10 mM DTT/1 mg-ml-1 BSA）をフローセルに通して洗浄した。 15マイクロリットルの0.5 mg/ml NeutrAvidin (Molecular Probes) をセルに加え、2分間インキュベートした後、ABバッファーでもう1回洗浄した。 フローセルを15μlのビオチン化ファロイジンアクチンフィラメント（250nM）と共に5分間インキュベートし、その後ABバッファーで100μl洗浄を行った。 最後に、カルモジュリン交換したミオシンV、5μMカルモジュリン、300nM ATP、ATP再生系（0.1mg-ml-1 クレアチンホスホキナーゼ／1mM クレアチンリン酸）、および非特異的結合を減らすために0.5％（vol／vol）Triton-X 100を含むイメージングバッファ20μlで細胞に負荷した。 細胞は真空グリースで密封し、直ちに画像化した。
DNA実験では、ビオチン-BSAとノイトラビジンをミオシンV実験と同じ方法でロードしたが、洗浄はT50バッファ（10 mM Tris, pH 8.0/50 mM NaCl）で行なった。 フローセルにNeutrAvidinコーティングを施した後、1 mg-ml-1 BSAを含むT50バッファ中の15 μlof dsDNA（30 nM）を流し、2分間インキュベートし、その後100 μlのイメージングバッファを流し込んだ。 その後、フローセルを真空グリースで密閉し、速やかにイメージングを行った。 その結果、表面上のDNA分子の装飾は十分にまばらで、異なる分子からの蛍光スポットが重なることはほとんどなかった
顕微鏡のセットアップ。 全反射蛍光（TIRF）顕微鏡は、文献に記載されているようにセットアップした。 8に記載されているように、若干の修正を加えてセットアップした（Fig.5、これはPNASのWebサイトにサポート情報として掲載されている）。 532 nm (Coherent, Santa Clara, CA) と 633 nm (JDS Uniphase, San Jose, CA) の励起光源ビームをダイクロイックミラーで結合し、直径7 mmに拡大した。 これらの光源をオリンパス社製 1.65 NA ×100 TIRF 対物レンズの後側焦点面に集光（焦点距離 = 500 mm）し，顕微鏡を落射蛍光または TIRF モードで操作できる線形 DeepL 翻訳上のレーザーライン・ダイクロイックを用いて集光させた． 対物レンズは，位置測定用の静電容量センサー（Physik Instrumente, Auburn, MA）を備えた閉ループ2軸のピエゾ式nanoDeepL移動機構の下に配置された。 対物レンズのバックアパーチャーから出た反射光は、四分円フォトダイオードに導かれ、電歪アクチュエータ（Newport, Fountain Valley, CA）で対物レンズとサンプル間の距離をクランプする焦点フィードバックループにシグナルを供給するために使用された。 蛍光発光は対物レンズで収集され、各励起源用に1つずつ、2つのStopLine薄膜ノッチフィルター（Semrock、Rochester、NY）を通過し、単一のiXon DV 887 EMCCDカメラ（Andor Technology、Belfast、アイルランド）でCy3およびCy5チャンネルの同時イメージングを可能にするデュアルビュー装置を通して送信された。 すべてのデータは0.5秒の積分時間で撮像された。 2つのチャンネル間のクロストーク（10％）は、おそらく距離測定値をより小さな値へと偏らせる。 しかし、我々の実験誤差は、DNAデータと同様に、10nm離れた単一蛍光体の100組のモデル画像を作成し、解析したモンテカルロシミュレーション（後述）により、検出不可能であることが示された。 蛍光点拡がり関数のシミュレーション画像は、ショットノイズを加えた一定のバックグラウンドで積分した2次元ガウス強度分布を生成することで算出した。 シミュレーションのピークは、実際のピークと同じ大きさ、S/N比であった。 10%のクロストークを含むシミュレーションデータとクロストークを含まないシミュレーションデータは、Kolmogorov-Smirnov検定で区別できない（N 1 = 100, N 2 = 100, p > 0.05）
データ解析。 100nmのTransFluoSphereビーズ（Molecular Probes）からなるフィデューシャルを用いて、Cy3およびCy5チャネルのレジストレーションマッピングを行った。 これらは532nmで励起され、広い発光スペクトルで発光する。 このビーズは両チャンネルで検出可能であった。 カバースリップに付着した1つのビーズを、ピエゾステージを使ってグリッドパターン（0.5μm間隔）でナノメートルの精度でステップさせ、停止ごとに画像を撮影しました。 その結果、312枚の画像を積み重ね、両チャンネルのビーズが異なる位置にあることを確認しました (図1a)。
2つのイメージングチャンネルの3.3nm以内の正確なアライメント。 0.5μm間隔のフィデューシャルグリッドは、ピエゾステージによって両方のチャンネルで検出可能な蛍光ビーズを並進させることによって作成された。 グリッドの各点で、ビーズの画像を撮影した。 (a)得られた画像のスタックをz方向に投影し、較正系列が訪れた位置を観察した。 (b) ビーズの中心位置は、2次元ガウス関数へのフィットによって求められた。 (c) その後の位置の組は、Cy5チャンネルのCy3チャンネルへの変換マッピングを計算するために使用された。
ビーズの中心は、そのそれぞれの空間における位置を決定するために、バックグラウンド、
を持つ2D楕円ガウス関数への最小二乗フィットによって求められた（図1b )。 実際には、σxとσyはほぼ同じであった。 これらの位置から、Cy5チャンネルからCy3チャンネルへの局所加重平均マッピング(23)を計算することができた（図1c ）。 このマッピングは、各フィデューシャルの周囲（半径 6 フィデューシャル以内）で局所的に決定された 2 次多項式の加重和である。 これにより、局所的に発生するレジストレーションエラーを、その影響が他の空間に及ぶことなく補正することができる。 このマッピングに伴うターゲット・レジストレーション・エラー（TRE）は次のように算出される。 各フィデューシャルを1つずつ独立させ、他のフィデューシャルを使用してマッピングを計算する。 Cy5チャンネルで取り残されたフィデューシャルの位置をCy3チャンネルの空間にマッピングし、マッピングされた位置とCy3チャンネルでのフィデューシャルの位置との偏差を記録する。 各Fiducialについて算出された偏差の大きさの平均値をTREとする。 このマッピングをCy5チャンネルに局在する色素に適用し、Cy3チャンネルの位置との相対的な位置を決定することができる。 色素の位置はピクセル単位で求められるため、ピクセルサイズによって変換する必要がある。 ピエゾステージでビーズを動かすと、実空間での位置の違いがわかるので、この同じキャリブレーションでピクセルサイズ（110 nm）を正確に測定することも可能です。 一般に、このキャリブレーションによって、数週間にわたって有効な変換マッピングが得られることがわかりました。 ただし、ここで報告するすべてのデータは、キャリブレーションが行われた当日に収集されたものである。
DNAデータは、matlab (Mathworks, Natick, MA) を使用した自作のソフトウェアで解析された。 このルーチンは、高強度のピクセルを決定することによって画像内のピークの位置を自動的に特定し、周囲のピクセルが単一の蛍光体について予想される強度を有することを保証するものである。 ピークを2次元ガウス関数にフィットさせてその中心位置を求める前に、ピークのペアを検索する。 Cy5 チャンネルで見つかったピクセルは Cy3 チャンネルにマッピングされ、周囲の Cy3 ピクセルのピークを検索します。 ピークが見つかった場合、そのCy5ピークとCy3ピークをペアとみなし、さらに解析を行います。 各ピークは、上記のビーズについて説明したように、それぞれの空間において2次元ガウス関数にフィットさせます（式1 ）。 フィットした平均位置の誤差は、収集した光子数(Nγ)で計算する。
Cy5の位置はCy3チャンネルにマッピングされ、それらの間の距離が計算される。 DNAデータの計算機解析後、同定された蛍光ペアを手動でスクリーニングし、ペアの解析に干渉するような他の蛍光ペアが近くにないことを確認した。
ミオシンVデータの解析は、まず動くモーターを目で見て同定することから始めた。 matlabで書かれた自家製のソフトウェアは、次に蛍光ピークの開始ペアを上記のように2次元ガウス関数に適合させ、ユーザーが指定した時間だけピークを追跡し続けた。 観察されたほとんどのモーターがそうであったように、共役色素がそれぞれ1回で光退色するモーターを分析し、実際に1つのCy3ラベルと1つのCy5ラベルのみを持つモーターを研究していることが確認された。 得られた軌跡は、Cy5軌跡をCy3チャンネルにマッピングすることで登録された。 両者の軌跡を最小二乗法で線形フィットさせると、軌跡が投影されたアクチンフィラメントの方向が得られた。 線形フィットに沿った距離（アクチンフィラメント）を時間に対してプロットし、頭部の相対距離を確認した（図4）。
アクチンフィラメントに沿って歩く、異なるラベルを付けたミオシンV分子の時間トレース。 ラベル（Cy3およびCy5）は、ミオシンV分子上で交換されたカルモジュリンに共有結合している。 このトレースでは、蛍光プローブの位置がともに72 nmステップしており、カルモデュリンがモータードメインの近くで交換されたことがわかる。 プローブの位置が交互に変わることで、ミオシンVの手と手をつないで歩く機構を直接観察することができる