Pathogenesis In Vitro
Columnar epithelial cells are dead-end cells that experience two extremes of pH at once. Apikalnie, są one skąpane w wysoce zasadowych płynów jelitowych i podstawowo są skąpane w lekko kwaśnej hemolimfy. Warunki te są trudne do naśladowania w hodowli komórkowej, co może tłumaczyć niedostatek dostępnych informacji na temat pierwotnego zakażenia.
Linie komórkowe, które wspierają replikację GV są rzadkie i obecnie istnieją tylko dla CpGV. W związku z tym, wiemy niewiele więcej o mechanizmach infekcji GV niż o infekcji ODV. Mimo to wiemy, że podczas morfogenezy nukleokapsydów GV dochodzi do rozpadu błony jądrowej komórki gospodarza, co nie zakłóca procesu przetwarzania nukleokapsydów. Zanikanie błony jądrowej jest charakterystyczne i nie występuje w komórkach gospodarza zakażonych NPV.
Ustalono szereg linii komórkowych owadów, które wspierają infekcje NPV. Większość z tych linii komórkowych pochodzi z jajników lub embrionów gąsienic. AcMNPV może replikować się w liniach komórkowych pochodzących od kilku gatunków owadów, co przyczynia się do tego, że jest on najlepiej zbadanym bakulowirusem. W standardowej, jednostopniowej krzywej wzrostu, BV AcMNPV jest zwykle wytwarzany 12-20 h po zakażeniu (hpi), a okluzje 20-48 hpi. Replikacja większości innych NPV w hodowli komórkowej trwa od kilku godzin do kilku dni dłużej.
AcMNPV BV jest 1000-krotnie bardziej zakaźny niż ODV, głównie z powodu obecności białka fuzyjnego, GP64. BV wnikają do komórek docelowych przez endocytozę wspomaganą przez klathrynę. Nukleokapsydy BV wnikają głęboko do cytoplazmy komórek docelowych poprzez uwolnienie z endosomów. Dzięki tej strategii nukleokapsydy omijają potencjalnie niebezpieczne środowisko, które znajduje się tuż pod błoną plazmatyczną i dostają się do komórki bliżej jądra, niż pozwalałaby na to fuzja w błonie plazmatycznej. Wrażliwe na pH zmiany konformacyjne, których doświadczają białka fuzyjne BV, służą do wywołania zdarzenia fuzji między otoczką wirusową a błoną endosomalną.
Po wydostaniu się nukleokapsydu ACMNPV z endosomu następuje natychmiast jego asocjacja z przewodami F-aktynowymi. Tworzenie kabli jest przejściowe i występuje w czasie, gdy nukleokapsyd wirusowy przemieszcza się do jądra i wchodzi do niego. Podczas tranzytu nukleokapsyd wirusowy łączy się z jednym z końców kabla aktynowego, prawdopodobnie za pośrednictwem P78/83, białka wiążącego F-aktynę, które prawdopodobnie znajduje się u podstawy nukleokapsydów. Powiązanie nukleokapsydów z przewodami aktynowymi F i opóźnienie ekspresji genów reporterowych w obecności leków zaburzających funkcje aktyny/miozyny sugeruje, że przewody mogą ułatwiać transport nukleokapsydów do jądra lub pośredniczyć w ich przejściu przez pory jądrowe.
NPV i niektóre nukleokapsydy GV wchodzą do jąder przez pory jądrowe. Niektóre GV odwarstwiają się w porach jądrowych, ale większość bakulowirusów odwarstwia się wewnątrz jądra. Natychmiast rozpoczyna się transkrypcja wczesnych genów, w której pośredniczy polimeraza RNA gospodarza II (Pol II). Wśród wczesnych genów ulegających ekspresji znajduje się podzbiór, którego ekspresja prowadzi do wydajnego transportu aktyny G do jądra i jej akumulacji w nim (Rysunek 5). Ta spektakularna manipulacja lokalizacją aktyny jest krytyczna dla produkcji potomstwa NPV i nie została opisana dla żadnego innego patogenu. Geny zaangażowane w jądrową lokalizację aktyny, zidentyfikowane w eksperymentach z transfekcją przejściową, obejmują ie1, pe38, Ac004, Ac152, he65 i Ac102. Dwa z tych genów, ie1 i Ac102, są konserwowane wśród wszystkich NPV i GV lepidoptera, i oba są niezbędne.
Ryc. 5. Jądrowa G-aktyna w komórkach zakażonych AcMNPV. (a) Zakażone komórki barwione 4′,6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI); (b) Zakażona komórka wyrażająca transfekowane białko zielonej fluorescencji (GFP)-aktynę. (c) Brak jądrowego barwienia faloidyną z rodaminy wskazuje, że aktyna jądrowa jest monomeryczna.
Przejście do późnego stadium infekcji jest początkiem okresu produkcji potomstwa BV; aktywność komórkowa jest nastawiona na syntezę składników wirusowych z maksymalną szybkością, składanie ich w produkty nukleokapsydu, a następnie ich eksport. Synteza makromolekularna gospodarza jest w tym okresie wyłączona, ale struktura chromatyny gospodarza pozostaje nienaruszona aż do śmierci komórki. Późne i bardzo późne geny wirusowe są wyrażane przez polimerazę RNA kodowaną przez wirusa.
Mikrotubule, zreorganizowane podczas wczesnej fazy infekcji, są depolimeryzowane przez czynniki produkowane podczas późnej fazy, co prowadzi do zaokrąglenia komórki (Figura 6). Podobnie, G-aktyna, zgromadzona w jądrze podczas wczesnej fazy, polimeryzuje podczas późnej fazy, równolegle z pęcznieniem jądra i zanikiem widocznych struktur jądrowych gospodarza (rysunek 7). Stroma wirogenna, miejsce syntezy wirusowego DNA, tworzy się w centrum jądra i jest poprzecinana i otoczona przez elektronowo świecącą strefę zwaną „strefą pierścieniową”, miejsce, w którym kapsydy są montowane i wiązane podczas ładowania genomu. Jądrowa F-aktyna kolokalizuje się z głównym białkiem kapsydu AcMNPV w strefie pierścienia (Rysunek 7).
Rysunek 6. Komórki Sf21 zainfekowane AcMNPV wykazujące różne fazy efektu cytopatycznego (CPE). (a) Komórki niezakażone. Zwraca uwagę wrzecionowaty kształt i obecność struktur nukleochromatyny. (b) Komórki zainfekowane AcMNPV wykazujące wczesną i późną fazę CPE. Komórki są zaokrąglone z powodu depolimeryzacji mikrotubul, jądra są większe i oczyszczone ze struktur gospodarza, a zrąb wirogenny (vs) jest otoczony przez strefę pierścieniową (rz). Stroma wirogenna staje się gęstsza w miarę postępu późnej fazy infekcji. Polihedry wypełniają jądro podczas bardzo późnego stadium infekcji (p).
Ryc. 7. Jądrowa F-aktyna w komórce zakażonej AcMNPV podczas późnej ekspresji genów. (a) Barwienie DAPI wskazuje lokalizację jądra. (b) Zielona fluorescencja wskazuje, że białko kapsydu jest zlokalizowane głównie w strefie pierścieniowej jądra. (c) Barwienie faloidyną z rodaminą pokazuje, że F-aktyna współlokuje się z kapsydem w strefie pierścienia.
Jądrowa F-aktyna jest wymagana do produkcji BV. W obecności leków zaburzających F-aktynę, kapsydy wirusowe są zniekształcone i pojawiają się jako długie rurkowate struktury przylegające do wewnętrznej błony jądrowej z rzadkimi płatami gęstego elektronowo materiału. Płytki podstawowe i struktury kapsydu normalnie obecne nie są widoczne, a nadmiar błonowych profili jest produkowany. Wirusowa synteza DNA zachodzi w normalnym tempie, ale genomy nie są upakowane, a zrąb wirogenny ma wygląd „zrelaksowany” w porównaniu z normalnym zrębem. Co ciekawe, fenotyp przy braku czynnika-1 (VLF-1) dla AcMNPV jest podobny, co sugeruje, że VLF-1 może być zaangażowany w wiązanie kapsydów do zrębu wirogennego i że F-aktyna jest składnikiem zrębu, do którego kapsydy są przyłączone, bezpośrednio lub pośrednio.
P78/83, pomniejsze białko kapsydu ulegające ekspresji późno podczas infekcji, jest niezbędne dla żywotności AcMNPV. Cecha ta została zauważona ponad 30 lat temu i wykorzystana w pierwszych komercyjnych zestawach do ekspresji bakulowirusów. Uważa się, że P78/83 (78 kDa w stanie niefosforylowanym i 83 kDa w stanie ufosforylowanym) jest częścią płytek podstawowych kapsydu zarówno BV jak i ODV. P78/83 jest białkiem wiążącym F-aktynę, a ta aktywność może pomagać w wiązaniu kapsydów do macierzy jądrowej podczas ich składania. Co ciekawe, P78/83 wykazuje inną aktywność, która wyjaśnia dlaczego jest niezbędna; promuje polimeryzację aktyny wewnątrz jądra. P78/83 zawiera domeny konserwowane przez członków rodziny białek zespołu Wiskott-Aldrich (WASP), czynników promujących nukleację filamentów aktynowych. Członkowie rodziny WASP pozytywnie reguluj± aktywno¶ć nukleacji aktyny przez kompleks białek pokrewnych aktynie (Arp)-2/3. Ten siedmiopodjednostkowy kompleks, konserwowany u eukariontów, jest przenoszony do jądra w komórkach zainfekowanych AcMNPV i aktywowany przez P78/83. Mutacje w P78/83, które prowadzą do zmniejszenia zdolności do promowania nukleacji aktyny, odpowiednio prowadzą do zmniejszenia zdolności do wytwarzania zakaźnych BV.
Natychmiast po wejściu do jądra, DNA AcMNPV przyjmuje strukturę nukleosomalną i wykorzystuje nukleosomy oraz procesy związane z nukleosomami w replikacji genomu. Składnikiem wirusowej strategii replikacyjnej wydaje się być zatem porywanie elementów, jeśli nie całej, zdolności przebudowy chromatyny gospodarza. Ostatnie dowody sugerują, że rodzina białek BRO (baculovirus repeated orf) prawdopodobnie uczestniczy w tym procesie. Białka BRO ulegają ekspresji we wczesnym okresie infekcji, wiążą jednoniciowe DNA (ssDNA) i histony rdzeniowe, a w eksperymentach frakcjonowania dzielą się z histonami. BmNPV, orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus i lymantria dispar multiple nucleopolyhedrovirus posiadają wiele genów bro. AcMNPV posiada tylko jeden gen bro, związany z genem bro-d BmNPV, który jest niezbędny.
AcMNPV-encoded P6.9, wysoce podstawowe białko pakowania genomu, zaczyna gromadzić się podczas późnego etapu infekcji i pojawia się alternatywna struktura chromatyny.
Interakcje P6.9-DNA są kontrolowane przez stan fosforylacji P6.9. Podczas pakowania genomu, genomowy DNA ze zrębu wirogennego wiąże się z P6.9, ponieważ P6.9 jest zdeposforylowany, kondensując się do wstępnie uformowanego płaszcza kapsydu przez otwór w stożkowej strukturze końcowej. Struktury stożkowe leżą proksymalnie w stosunku do zrębu wirogennego, przy czym osłonki kapsydu są przykryte płytkami podstawnymi, które rozciągają się dystalnie do przestrzeni o mniejszej gęstości elektronowej, strefy pierścieniowej. F-aktyna i białka kapsydu kolokalizują się w strefie pierścienia, wraz z P78/83 i kompleksem Arp2/3. To właśnie na ten etap replikacji mają wpływ zarówno leki, które zaburzają F-aktynę, jak i brak VLF-1.
Z początkiem bardzo późnej fazy zakażenia następuje zmniejszenie produkcji BV i pojawia się produkcja ODV. Nowo zmontowane nukleokapsydy pozostają w jądrze, gdzie są zawijane w otoczki, które uważane są za pochodzące z wewnętrznej błony jądrowej. Otoczki wirusów, ale nie nierozwinięte nukleokapsydy, zostają zamknięte w matrycy białkowej, tworząc kapsuły lub wielościany. Komórki ostatecznie ulegają rozpadowi, uwalniając okluzje do środowiska.
.