PMC

THE PROMISE OF IMPROVED THERAPIES THROUGH MOLECULAR STUDIES OF FETAL HEMOGLOBIN REGULATION

Ale omówione powyżej nieukierunkowane metody terapeutyczne okazały się obiecujące i odniosły pewien sukces w indukowaniu HbF w warunkach klinicznych, Lepsze mechanistyczne zrozumienie podstaw molekularnych koniecznych do normalnego przełączenia hemoglobiny płodowej na hemoglobinę dorosłą jest bardzo obiecujące i pozwala na opracowanie bardziej skutecznych i specyficznie ukierunkowanych metod indukcji HbF. W dziesięcioleciach po molekularnym sklonowaniu genów globiny, zidentyfikowano wiele czynników transkrypcyjnych, które odgrywały rolę w regulacji genów globiny (Cantor i Orkin 2002). Należały do nich czynniki transkrypcyjne takie jak GATA1, KLF1 i SCL/ TAL1. Jednakże, badanie roli tych czynników w regulacji genów globiny było utrudnione z powodu szerokiej roli tych czynników w różnicowaniu i ich plejotropowych ról jako regulatorów regulacji genów globiny i erytroidów. Żaden z tych czynników nie wydawał się być specyficznym regulatorem zmiany hemoglobiny z płodowej na dorosłą. Minęły prawie trzy dekady od początkowego sklonowania genów globiny, zanim zidentyfikowano specyficzne regulatory tego procesu.

Ważne wskazówki dotyczące tożsamości takich czynników pochodzą z badań nad naturalną zmiennością genetyczną człowieka. Wiele grup poszukiwało podstaw wspólnej zmienności genetycznej w poziomie HbF, stosując zarówno ukierunkowane, jak i szerokie badania asocjacyjne (GWAS) (Menzel i wsp. 2007; Thein i wsp. 2007; Lettre i wsp. 2008; Uda i wsp. 2008). Badania te doprowadziły do zidentyfikowania trzech loci genomowych zawierających wspólne warianty wpływające na poziom HbF. Obejmowały one region chromosomu 2 w obrębie genu BCL11A, region intergeniczny pomiędzy genami HBS1L i MYB na chromosomie 6 oraz warianty w obrębie locus β-globiny na chromosomie 11. Ostatnie badania, w których dokładniej zmapowano te warianty genetyczne, sugerują, że >50% zmienności poziomu HbF można wyjaśnić wspólną zmiennością w tych trzech loci (Galarneau i wsp. 2010). Chociaż uważa się, że poziomy HbF mają dziedziczny komponent genetyczny w zakresie ∼80%, należy pamiętać, że addytywna zmienność genetyczna stwierdzona na podstawie wspólnych wariantów genetycznych pomija potencjalne interakcje genetyczne wyższego rzędu, które mogą nie zostać wykryte, a zatem zakres, w jakim poziomy HbF są uwarunkowane genetycznie, pozostaje do zbadania w przyszłych badaniach (Zuk i in. 2012).

Wstępna obserwacja wariantów związanych z poziomem HbF w obrębie cynkowo-pierścieniowego czynnika transkrypcyjnego BCL11A doprowadziła do wstępnego badania, w którym postawiono hipotezę, że BCL11A może być regulatorem ekspresji HbF (Sankaran i wsp. 2008). Wcześniejsze prace sugerowały, że BCL11A jest krytycznym regulatorem transkrypcyjnym zaangażowanym w limfopoezę B i neurogenezę (Sankaran i wsp. 2010). Poziom białka BCL11A wydaje się korelować z etapem rozwojowym ekspresji, tak że prymitywne i płodowe komórki erytroidalne wątroby, które wyrażały wysoki poziom γ-globiny, miały niską lub nieobecną ekspresję form BCL11A o pełnej długości. Wynik ten sugerował, że produkt tego genu działał jako represor genów γ-globiny. Aby to bezpośrednio sprawdzić, w pierwotnych progenitorach dorosłych erytroidów przeprowadzono knockdown BCL11A przy użyciu metod shRNA (short-hairpin RNA) i ekspresja γ-globiny mogła być silnie indukowana przez taki knockdown. Stopień indukcji γ-globiny wydaje się być związany z zakresem knockdownu BCL11A. Interesujące jest to, że główne zaburzenia w erytropoezie nie wystąpiły pomimo silnej indukcji γ-globiny. Dalsze badania wykazały podobne wyniki przy obniżaniu ekspresji BCL11A za pomocą shRNA (Borg i wsp. 2010; Zhou i wsp. 2010; Wilber i wsp. 2011). Dodatkowo wykazano, że BCL11A bezpośrednio oddziałuje z chromatyną w locus ludzkiej β-globiny w pierwotnych komórkach erytroidalnych i że wydaje się działać jako część kompleksu z czynnikiem transkrypcyjnym GATA1 i kompleksem NuRD remodelującym chromatynę i represorowym (Sankaran i wsp. 2008). Co ciekawe, kompleks NuRD zawiera HDACs 1 i 2, które, jak sugerowano, są krytycznymi HDACs niezbędnymi do wyciszenia HbF (Bradner i wsp. 2010). Ponadto zasugerowano, że czynnik transkrypcyjny SOX6 może współpracować z BCL11A w wyciszaniu genów γ-globiny u ludzi i może być niezbędny do wiązania proksymalnego promotora tych genów globiny (Xu i wsp. 2010).

Chociaż przełączanie hemoglobiny w modelach mysich, nawet tych posiadających ludzki transgen locus β-globiny, wydaje się odbiegać od normalnej ontogenezy ekspresji globiny obserwowanej u ludzi, ewolucyjnie konserwowana rola BCL11A w wyciszaniu i przełączaniu genów globiny została wykazana u myszy (Sankaran i wsp. 2009; McGrath i wsp. 2011). Myszy pozbawione BCL11A wydają się mieć normalną erytropoezę, ale nie są w stanie w pełni wyciszyć embrionalnych genów globiny w ostatecznych komórkach erytroidalnych i pozwalają na utrzymującą się ekspresję γ-globiny, gdy obecny jest nienaruszony ludzki locus β-globiny. Odkrycia te wzmacniają znaczenie BCL11A jako krytycznego mediatora przełączania globiny u ssaków. Chociaż to pierwsze badanie dotyczyło roli BCL11A w procesie rozwojowym przełączania globiny u myszy (Sankaran i wsp. 2009), nowsze badanie wykorzystało warunkową inaktywację BCL11A do wykazania, że indukowana inaktywacja może skutkować silną i podobną intensywnością indukcji genu γ-globiny, jak w przypadku inaktywacji we wcześniejszych okresach (Xu i wsp. 2011). Ponadto, chociaż istnieje zróżnicowana regulacja genów globiny między ludźmi i myszami, inaktywacja BCL11A okazała się wystarczająca do poprawy hematologicznych i patologicznych cech obserwowanych w mysich modelach choroby sierpowatokrwinkowej, zapewniając ważny dowód zasadniczy dla potencjalnej skuteczności celowania w BCL11A w celu indukcji HbF (Xu et al. 2011).

Dokładne mechanizmy, dzięki którym BCL11A wycisza ekspresję genów γ-globiny, pozostają niejasne. Ostatnie badania sugerują, że może to być pośredniczone zarówno przez interakcje z czynnikami transkrypcyjnymi, takimi jak SOX6, które wiążą chromatynę w proksymalnych promotorach γ-globiny, jak również przez interakcje dalekiego zasięgu z różnymi regionami w całym klastrze genów β-globiny (Xu i wsp. 2010). Gdy BCL11A jest nieobecny, konformacja locus β-globiny zmienia się w taki sposób, że enhancer upstream znany jako region kontrolny locus jest zestawiony z aktywowanymi transkrypcyjnie genami γ-globiny. Podobne zjawisko występuje, gdy komórki są traktowane inhibitorami HDAC, które indukują ekspresję genów γ-globiny (Bradner i wsp. 2010). Nie jest jednak jasne, czy w tych zmianach konformacyjnych pośredniczy bezpośrednio BCL11A, czy też zmiany te zachodzą wtórnie do indukującego HbF efektu inhibicji BCL11A (lub HDAC). Niemniej jednak, wyniki te silnie wspierają koncepcję, że BCL11A wydaje się mieć bezpośrednią rolę w wyciszaniu ekspresji γ-globiny w obrębie locus β-globiny. Poprzez mapowanie różnych delecji w obrębie ludzkiego locus β-globiny, które albo prowadzą do δβ-talasemii, z umiarkowanym wzrostem HbF i pewną obecną nierównowagą łańcuchów globinowych, albo HPFH, z silnym wzrostem HbF i zrównoważoną syntezą łańcuchów globinowych, wykazano, że region N3-kb upstream genu δ-globiny jest niezbędny do wyciszania genów γ-globiny (ryc. 2) (Sankaran i wsp. 2011c). Co ciekawe, w tym regionie znajdują się miejsca wiązania dla BCL11A, wraz z jego partnerami, takimi jak GATA1 i HDAC1. Warto zauważyć, że region ten został również niezależnie wskazany jako ważny dla wyciszania γ-globiny w badaniach nad delecją Corfu talasemii u ludzi (Chakalova i wsp. 2005). Badanie to dostarcza ważnego mechanistycznego wglądu w to, jak BCL11A funkcjonuje w celu wyciszenia HbF i wzmacnia znaczenie naturalnych ludzkich mutacji w zrozumieniu tego procesu rozwojowego, który jest unikalny dla ludzi (Ryc. 2) (Sankaran i wsp. 2011c).

Biorąc pod uwagę te ustalenia, BCL11A może być ważnym celem terapeutycznym. Fakt, że jego inaktywacja indukuje HbF bez powodowania poważnych zaburzeń w erytropoezie jest bardzo obiecujący, chociaż wiadomo, że ma on ważne efekty w innych liniach, takich jak limfocyty B, podkreślając znaczenie modelowania i analizy in vivo jako części trwających wysiłków mających na celu ukierunkowanie BCL11A na indukcję HbF. Dalsze badania nad mechanizmami działania BCL11A mogą doprowadzić do opracowania lepszych i bardziej specyficznie ukierunkowanych metod indukcji HbF (Sankaran i wsp. 2011c). SOX6 może być również potencjalnie obiecującym celem dla indukcji HbF (Xu i wsp. 2010), chociaż wiadomo, że jest on niezbędny dla prawidłowej erytropoezy (Dumitriu i wsp. 2006). Jednakże opisano pacjenta z heterozygotycznym zaburzeniem SOX6, który nie miał podwyższonego poziomu HbF, co sugeruje, że gen SOX6 może mieć mechanizm kompensacji dawki lub że może istnieć szczególny próg konieczny do zmniejszenia ekspresji tego genu, aby uzyskać silną indukcję HbF (Sankaran i wsp. 2011a). To sugeruje, że mogą istnieć ograniczenia w rozważaniu SOX6 jako potencjalnego celu indukcji HbF.

Po początkowych badaniach nad BCL11A, dwa badania sugerowały, że ekspresja BCL11A wydaje się być kontrolowana przez erytroidalny specyficzny czynnik transkrypcyjny KLF1 przy użyciu niezależnych i uzupełniających się podejść. W jednym z badań, myszy z hipomorficznym allelem KLF1 spowodowały wzrost ekspresji globiny embrionalnej, a myszy transgeniczne z ludzkim locus β-globiny wykazały trwałą ekspresję γ-globiny (Zhou i wsp. 2010). W związku z tym badacze sprawdzili, czy taka sama regulacja może zachodzić w pierwotnych ludzkich komórkach erytroidalnych i czy mogą wykazać podobny związek przy użyciu metod shRNA. Badacze wykazali, że efekt ten zachodzi zarówno poprzez bezpośredni wpływ KLF1 na locus β-globiny, ale także poprzez pośredni wpływ mediowany przez zmniejszoną ekspresję BCL11A w wyniku knockdown KLF1. To odkrycie wykazało, że KLF1 jest bezpośrednim pozytywnym regulatorem transkrypcyjnym ekspresji BCL11A. Druga grupa badała genetyczne podstawy niepowiązanej formy HPFH, która, jak sugerowano, jest wynikiem mutacji missense KLF1 w tej rodzinie (Borg i wsp. 2010). Badacze mogli wykazać, używając komórek pierwotnych od tych pacjentów i od osób z grupy kontrolnej, że obserwowany efekt był częściowo przypisywany wyciszającemu działaniu KLF1 na BCL11A. Jeden z obszarów utrzymującej się niepewności odnosi się do ludzkich fenotypów obserwowanych w różnych przypadkach mutacji KLF1. Chociaż w początkowym raporcie wszyscy biorcy mutacji missense mieli podwyższoną ekspresję HbF, należy zauważyć, że w rzeczywistości wahała się ona między 3% a 19% całkowitego poziomu hemoglobiny. Ponadto, inne doniesienia o heterozygotycznych mutacjach KLF1 u ludzi wskazują na jednoczesne zaburzenie erytropoezy lub wykazują niewielki wpływ na ekspresję HbF (Arnaud i wsp. 2010; Satta i wsp. 2011). Nowsze badania sugerują, że rzadkie warianty KLF1 rzeczywiście wiążą się z podwyższeniem poziomu HbF, ale nie wydaje się to występować konsekwentnie lub w tym samym stopniu nawet w przypadku podobnych mutacji (Gallienne i wsp. 2012). Podstawa tego zróżnicowania pozostaje do ustalenia i będzie ważna dla lepszego zrozumienia mechanizmów, za pomocą których KLF1 działa zarówno bezpośrednio, jak i pośrednio, aby wpływać na ekspresję HbF. Będzie to miało decydujące znaczenie dla wszelkich przyszłych prac mających na celu ukierunkowanie KLF1 na indukcję HbF, szczególnie jeśli chcemy uniknąć niepożądanych skutków takiej inhibicji dla różnicowania erytroidów. Jednakże, biorąc pod uwagę swoistość KLF1 w obrębie linii erytroidalnej i jeśli aktywność KLF1 regulująca gen globiny mogłaby być swoiście ukierunkowana, należy ją nadal uważać za kandydata do indukowania HbF.

W dodatku do wspólnych wariantów genetycznych zidentyfikowanych w BCL11A związanych z poziomem HbF u ludzi, badania GWAS wykazały, że istnieją warianty na chromosomie 6 intergeniczne pomiędzy genami HBS1L i MYB, które wydają się mieć dramatyczny wpływ na poziom HbF u ludzi (Menzel i wsp. 2007; Thein i wsp. 2007; Lettre i wsp. 2008; Uda i wsp. 2008). Zrozumienie mechanizmu działania, dzięki któremu warianty te powodują zmiany w poziomie HbF, jest ważne, ponieważ warianty genetyczne w tym locus wydają się mieć równie duży, a może nawet większy wpływ na zachorowalność w β-hemoglobinopatiach niż warianty w locus BCL11A (Galanello i wsp. 2009; Nuinoon i wsp. 2010). Co ciekawe, region ten zawiera wiele elementów regulatorowych, które, jak sugerowano, odgrywają istotną rolę w regulacji ekspresji MYB w progenitorach erytroidalnych (Mukai i wsp. 2006; Wahlberg i wsp. 2009; Stadhouders i wsp. 2011). Chociaż nadekspresja HBS1L nie wydaje się wpływać na ekspresję γ-globiny w komórkach erytroleukemii K562, nadekspresja MYB wydaje się wpływać na poziom γ-globiny produkowanej w tych komórkach (Jiang i wsp. 2006). Ponadto hodowle pierwotnych progenitorów erytroidalnych od ludzi z wyższą ekspresją HbF częściej miały obniżoną ekspresję MYB (Jiang i wsp. 2006).

Podążając za klasyczną obserwacją kliniczną, że pacjenci z trisomią chromosomu 13 mają opóźnioną zmianę hemoglobiny z płodowej na dorosłą i nadal mają trwałą ekspresję HbF (Huehns i wsp. 1964; Sankaran i Sapp 2012), ostatnie badania dostarczyły dalszych dowodów na rolę MYB w regulacji ekspresji HbF. Poprzez dokładne mapowanie i integracyjną analizę genomiczną genów w regionie chromosomu 13, który jest niezbędny do podwyższenia HbF obserwowanego u pacjentów z częściową trisomią chromosomu 13, odkryto, że istnieją dwie małe cząsteczki RNA o nukleotydach ∼22, które są najlepszymi kandydatami do wykonywania takiej aktywności, mikroRNA 15a i 16-1 (Sankaran i wsp. 2011b). Nadekspresja tych mikroRNA w pierwotnych dorosłych komórkach erytroidalnych w hodowli spowodowała wzrost produkcji γ-globiny. Badając cele tych mikroRNA zauważono, że jednym z głównych celów w komórkach erytroidalnych jest MYB. Bezpośrednie wyłączenie MYB w pierwotnych dorosłych progenitorach erytroidalnych spowodowało dramatyczny wzrost produkcji γ-globiny (Sankaran i wsp. 2011b), łącząc tę historyczną obserwację z rzadkiego ludzkiego zespołu aneuploidii z nowszymi pracami badającymi molekularne mechanizmy regulujące poziomy HbF.

Mechanizm, za pomocą którego MYB może działać w celu regulacji poziomów HbF pozostaje niejasny. Może to być spowodowane wpływem na kinetykę erytropoezy lub alternatywnie może również wystąpić w wyniku bezpośredniego wpływu w obrębie locus β-globiny (Higgs i Wood 2008). Konieczne będą dalsze prace w celu zbadania tych mechanizmów, które są bardzo obiecujące w próbach terapeutycznego ukierunkowania tej cząsteczki na indukcję HbF. Istnieją obawy, że ukierunkowanie MYB może mieć niepożądane efekty uboczne, szczególnie biorąc pod uwagę plejotropową rolę MYB w hematopoezie (Emambokus i wsp. 2003; Carpinelli i wsp. 2004). Jednak ostatnie prace sugerują, że takie strategie mogą być obiecujące, ponieważ częściowe wyciszenie Myb u myszy miało niewielki wpływ na normalną hematopoezę in vivo, podczas gdy dramatycznie blokowało progresję białaczek (Zuber i wsp. 2011a). Dlatego też częściowa inhibicja MYB może być obiecującą strategią dla indukcji HbF. Addytywność efektów wariantów w regionie intergenicznym HBS1L-MYB wraz z wariantami w locus BCL11A (Lettre et al. 2008; Galanello et al. 2009; Nuinoon et al. 2010) sugeruje, że ukierunkowanie na oba te szlaki razem mogłoby przynieść jeszcze silniejsze efekty niż ukierunkowanie na którykolwiek z tych szlaków osobno.

Pomimo że omówione powyżej regulatory regulacji HbF zostały znalezione w badaniach genetycznych u ludzi, potwierdzając w ten sposób ich znaczenie in vivo u ludzi, sugeruje się również, że wiele innych cząsteczek odgrywa rolę w regulacji genu γ-globiny w różnych badaniach z wykorzystaniem metod hodowli komórkowych lub modeli mysich (Tabela 1). Cz±steczki te zostan± omówione poniżej. Należy pamiętać, że większość dostępnych obecnie systemów doświadczalnych wykorzystywanych do badania regulacji genu γ-globiny ma pewne ograniczenia. Pierwotne ludzkie komórki erytroidalne wydają się być podatne na manipulacje, które pozwolą na zwiększenie produkcji γ-globiny, co nie zawsze może być istotne u ludzi in vivo. Ponadto, wiele bodźców, o których wiadomo, że indukują produkcję γ-globiny in vivo u ludzi, w tym różne rodzaje erytropoezy stresowej i leczenie hydroksymocznikiem, nie działa w celu indukowania produkcji γ-globiny w humanizowanych modelach myszy (Pace i wsp. 1994; Sankaran i wsp. 2009) podkreślając ważne ograniczenie dla interpretacji negatywnych wyników w tym systemie eksperymentalnym. Dlatego należy zachować ostrożność przy interpretacji wyników badań eksperymentalnych niepopartych dowodami z badań genetycznych u ludzi lub badań przeprowadzonych u ludzi lub naczelnych in vivo.

Badając białka, które wiążą bezpośrednie elementy powtórzone znajdujące się w obrębie promotora genów γ-globiny, sugeruje się, że sieroce receptory hormonów jądrowych TR2 i TR4 odgrywają rolę jako represory ekspresji genów γ-globiny (Tanabe i in. 2002, 2007; Cui i wsp. 2011). Paradoksalnie, nadekspresja TR2 i TR4 w transgenicznych modelach mysich skutkuje podwyższoną ekspresją γ-globiny, a w przypadku nadekspresji w mysich modelach choroby sierpowatokrwinkowej może skutkować częściową poprawą objawów hematologicznych i patologicznych u tych myszy (Campbell i wsp. 2011). Mechanizmy leżące u podstaw tych obserwacji i ich znaczenie dla regulacji genów globiny u ludzi pozostaje do ustalenia dla TR2 i TR4. Ponadto sugeruje się, że sierocy hormon jądrowy receptor jądrowy COUP-TFII również wiąże się do bezpośrednich powtórzeń i represjonuje promotor γ-globiny u ludzi (Filipe i wsp. 1999). Wykorzystując hodowle in vitro pierwotnych dorosłych komórek erytroidalnych wykazano, że cytokiny takie jak SCF wydają się zmniejszać ekspresję i zajętość chromatyny COUP-TFII w locus β-globiny, co skutkuje zwiększoną ekspresją γ-globiny (Aerbajinai i wsp. 2009). Ponadto, bezpośrednia regulacja COUP-TFII za pomocą małych interferujących RNA (siRNA) może skutkować zwiększeniem produkcji γ-globiny (Aerbajinai i wsp. 2009). Dalsze badania nad rolą COUP-TF w regulacji HbF będą konieczne, aby lepiej zrozumieć jej fizjologiczną rolę u ludzi.

Ostatnie badania sugerują również rolę genu nazwanego przyjacielem PRMT1 (FOP1) w represji ekspresji genu γ-globiny (van Dijk i wsp. 2010). Znokautowanie FOP1 skutkuje podwyższoną ekspresją HbF w ludzkich dorosłych komórkach erytroidalnych w hodowli. Sugerowano, że dzieje się tak za sprawą zmniejszonej ekspresji SOX6, którego knockdown również powoduje wzrost produkcji γ-globiny (Xu i wsp. 2010). Dalsze prace będą konieczne w celu potwierdzenia tych ustaleń, zrozumienia, czy ten gen ma również rolę w erytropoezie szerzej, i zbadania mechanizmu leżącego u podstaw tych obserwacji.

Niektóre badania sugerują również rolę dla białka selektora etapów NF-E4 jako aktywatora ekspresji γ-globiny u ludzi (Jane i wsp. 1995; Zhao i wsp. 2006). Zasugerowano, że krótka forma NF-E4 może odgrywać rolę w represji genów γ-globiny poprzez hamowanie normalnej aktywującej funkcji NF-E4 w promotorze tych genów (Zhou i wsp. 2004). Wszystkie te badania opierały się na eksperymentach przeprowadzonych w hodowlanych komórkach i biochemicznym oczyszczaniu kompleksów białkowych z komórek K562, dlatego konieczne będą dalsze prace w celu potwierdzenia fizjologicznej roli tego genu w ekspresji γ-globiny i lepszego zrozumienia mechanizmów, poprzez które ten kompleks może działać w celu zmiany regulacji ludzkich genów globiny.