Materiały i Metody
Dupleksowe DNA Przygotowanie. Aby wytworzyć 30-bp dupleksowe cząsteczki DNA, hybrydyzowano dwa oligonukleotydy o następującej sekwencji i modyfikacjach (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Oligonukleotyd 5′-GGGTATGGAGATTTTAGCGAGTGACAGC-3′ znakowano Cy5 na jego 5′ końcu i Cy3 na jego 3′ końcu. Komplementarny oligonukleotyd był znakowany biotyną na obu końcach.
Ekspresja i oczyszczanie białka. Gen białka żółtej fluorescencji (YFP) w plazmidzie p2Bac/pFastBac-YFP-M5-CaM (dar od H. Lee Sweeney, University of Pennsylvania, Philadelphia) został usunięty przez PCR. Powstały w ten sposób plazmid p2Bac/pFastBac-M5-CaM koduje miozynę V kurczaka obciętą przy Glu-1099. Suwak leucynowy podąża za natywną cewką, aby zapewnić dimeryzację. Aby ułatwić oczyszczanie, białko miozyny V zostało oznaczone N-końcowym znacznikiem FLAG (DYKDDDDK). Dwa rekombinowane bakulowirusy zostały wygenerowane w celu ekspresji białka w komórkach Sf9. Jeden kodował skróconą miozynę V i kalmodulinę Drosophila melanogaster pochodzącą z plazmidu p2Bac/pFastBac-M5-CaM. Drugi wirus kodował ludzki niezbędny łańcuch lekki pochodzący z plazmidu p2Bac/pFastBac-ELC. Oba wirusy zostały użyte do koinfekcji komórek Sf9. Białko uległo ekspresji i oczyszczeniu zgodnie z opisem Sweeney et al. (20).
Znakowanie i wymiana kalmoduliny. Kalmodulinę poddano ekspresji i znakowano Cy3 lub Cy5 w następujący sposób: Pojedyncza cysteina została wprowadzona do kalmoduliny jeżowca za pomocą mutacji Q143C. Ta kalmodulina została wyrażona w Escherichia coli i oczyszczona jak opisano w ref. 21. Kalmodulinę znakowano roztworami podstawowymi Cy3-maleimidu lub Cy5-maleimidu (Amersham Biosciences) (w DMSO) w 1,4-krotnym stosunku molowym przez 20 min. Nadmiar barwnika usuwano przez filtrację żelową do buforu do wymiany (poniżej), a następnie przez noc absorbowano hydrofobowo na BioBeads (Bio-Rad). Inkorporacja znacznika wynosiła 102% dla Cy3-kalmoduliny i 75% dla Cy5-kalmoduliny. Alikwoty przechowywano w temperaturze -80°C.
Wymiana znakowanej kalmoduliny na miozynę V została przeprowadzona zgodnie z opisem, ale z pewnymi modyfikacjami (22). Miozynę V (150 nM) inkubowano z 0,7 nM kalmoduliną znakowaną Cy3 i 0,8 nM kalmoduliną znakowaną Cy5 w buforze do wymiany (25 mM KCl/20 mM imidazol HCl, pH 7,4/2 mM MgCl2/1 mM EGTA) w 22 ° C przez 2 minuty. W celu wymiany kalmodulin dodawano 0,9 mM CaCl2 i inkubowano mieszaninę w 22°C przez 5 min. Reakcję wygaszano 7 mM EGTA. Mieszaninę reakcyjną nanoszono na urządzenie do ultrafiltracji Nanocep 100K MWCO (Pall) i przemywano trzykrotnie równymi objętościami AB (poniżej) w celu oczyszczenia miozyny V z nadmiaru kalmoduliny.
Przygotowanie kuwety przepływowej. Komórka przepływowa została skonstruowana ze szklanego szkiełka mikroskopowego i wysoce refrakcyjnych szkiełek nakrywkowych wykonanych z NLAF21 (VA Optical Labs, San Anselmo, CA) utrzymywanych razem przez kawałki dwustronnej taśmy Scotch.
Do doświadczeń z miozyną V, 15 μl biotyny-BSA (1 mg-ml-1) inkubowano w komórce przepływowej przez 2 min, po czym 30 μl buforu AB (25 mM KCl/25 mM imidazolu HCl, pH 7,4/1 mM EGTA/4 mM MgCl2/10 mM DTT/1 mg-ml-1 BSA) przepuszczono przez komórkę przepływową, aby ją wypłukać. Do kuwety dodano 15 mikrolitrów 0,5 mg/ml NeutrAvidin (Molecular Probes) i pozwolono na inkubację przez 2 min, po czym wykonano kolejne płukanie buforem AB. Komórkę inkubowano z 15 μl biotynylowanej faloidyny filamentów aktynowych (250 nM) przez 5 min, a następnie przemywano 100 μl buforem AB. Na koniec komórkę obciążano 20 μl buforu do obrazowania zawierającego miozynę V wymienioną na kalmodulinę, 5 μM kalmoduliny, 300 nM ATP, system regeneracji ATP (0,1 mg-ml-1 fosfokinazy kreatynowej/1 mM fosforanu kreatyny) i 0,5% (obj./obj.) Triton-X 100 w celu zmniejszenia wiązania niespecyficznego. Komórkę uszczelniano smarem próżniowym i natychmiast obrazowano. Końcowe stężenie silnika dało w rezultacie słabo udekorowaną aktynę i w ten sposób umożliwiło analizę pojedynczych cząsteczek miozyny V.
Do eksperymentów z DNA, biotyna-BSA i NeutrAwidyna zostały załadowane w ten sam sposób jak do eksperymentów z miozyną V, ale płukanie zostało wykonane buforem T50 (10 mM Tris, pH 8.0/50 mM NaCl). Gdy komórka przepływowa pokryła się NeutrAvidiną, wpuszczono 15 μl dsDNA (30 nM) w buforze T50 z 1 mg-ml-1 BSA i inkubowano przez 2 min, po czym wpuszczono 100 μl buforu do obrazowania. Komórka przepływowa była następnie zamykana smarem próżniowym i natychmiast obrazowana. Powstała dekoracja cząsteczek DNA na powierzchni była na tyle nieliczna, że plamki fluorescencyjne z różnych cząsteczek rzadko się nakładały.
Konfiguracja mikroskopu. Mikroskop do fluorescencji z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) został ustawiony jak opisano w ref. 8, z pewnymi modyfikacjami (Rys. 5, który jest opublikowany jako informacja dodatkowa na stronie internetowej PNAS). Wiązki źródeł wzbudzających o długości fali 532 nm (Coherent, Santa Clara, CA) i 633 nm (JDS Uniphase, San Jose, CA) zostały połączone przez lustro dichroiczne i rozszerzone do średnicy 7 mm. Źródła te zostały zogniskowane (ogniskowa = 500 mm) na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu Olympus 1.65 NA ×100 TIRF za pomocą dichroika linii laserowej na liniowej translacji DeepL, która umożliwia pracę mikroskopu w trybach epifluorescencji lub TIRF. Obiektyw był pozycjonowany w zamkniętej pętli, dwuosiowy, piezoelektryczny translator nanoDeepL wyposażony w czujniki pojemnościowe do pomiaru położenia (Physik Instrumente, Auburn, MA). Odbite światło wychodzące z tylnej apertury obiektywu było kierowane na fotodiodę kwadrantową w celu dostarczenia sygnału do pętli sprzężenia zwrotnego ostrości, która zaciskała odległość między obiektywem a próbką za pomocą siłownika elektrostrykcyjnego (Newport, Fountain Valley, CA). Emisja fluorescencji była zbierana przez obiektyw, przepuszczana przez dwa cienkowarstwowe filtry StopLine (Semrock, Rochester, NY), po jednym dla każdego źródła wzbudzenia, i przesyłana przez aparat o podwójnym polu widzenia, który umożliwiał jednoczesne obrazowanie kanałów Cy3 i Cy5 na pojedynczej kamerze iXon DV 887 EMCCD (Andor Technology, Belfast, Irlandia). Wszystkie dane były obrazowane z 0,5-sekundowym czasem integracji. Przesłuchy między dwoma kanałami (10%) przypuszczalnie skłaniają pomiary odległości do mniejszych wartości. Nasz błąd eksperymentalny jest jednak niewykrywalny, co pokazały symulacje Monte Carlo, w których utworzono 100 par modelowanych obrazów pojedynczych fluoroforów oddzielonych od siebie o 10 nm i analizowano je identycznie jak dane DNA (opisane poniżej). Symulowane obrazy funkcji rozrzutu punktów fluorescencyjnych zostały obliczone poprzez wygenerowanie zintegrowanego 2D rozkładu intensywności gaussowskiego ze stałym tłem, do którego dodano szum śrutu. Symulowane piki miały takie same wymiary i stosunek sygnału do szumu jak prawdziwe piki. Symulowane dane z 10% przesłuchów i symulowane dane bez przesłuchów są nieodróżnialne testem Kołmogorowa-Smirnowa (N 1 = 100, N 2 = 100, p > 0,05).
Analiza danych. Mapowanie rejestracyjne kanałów Cy3 i Cy5 przeprowadzono z użyciem fiducials składających się z 100-nm kulek TransFluoSphere (Molecular Probes). Były one wzbudzane przy długości fali 532 nm i emitowały szerokie spektrum emisyjne. Perełki były wykrywalne w obu naszych kanałach. Umieściliśmy pojedynczą kulkę związaną z szkiełkiem nakrywkowym i za pomocą naszego piezoelektrycznego stolika przesuwaliśmy ją z nanometrową precyzją we wzorze siatki (z odstępem 0,5 μm), wykonując zdjęcie przy każdym zatrzymaniu. Rezultatem końcowym był stos 312 obrazów, które pokazują koralik w obu kanałach w różnych pozycjach (Rys. 1a ).
Dane DNA zostały przeanalizowane przez domowe oprogramowanie wykorzystujące matlab (Mathworks, Natick, MA). Procedura automatycznie lokalizuje piki na obrazie poprzez określenie pikseli o wysokiej intensywności i zapewnia, że otaczające piksele mają intensywności zgodne z oczekiwaniami dla pojedynczego fluoroforu. Przed dopasowaniem pików do dwuwymiarowej funkcji gaussowskiej w celu uzyskania położenia ich środka, szukamy par pików. Piksele znalezione w kanale Cy5 mapowane są na kanał Cy3 i wyszukiwane są piki w otaczających je pikselach Cy3. Jeśli pik zostanie znaleziony, wówczas pik Cy5 i pik Cy3 są traktowane jako para do dalszej analizy. Każdy pik jest dopasowywany do funkcji gaussowskiej 2D w swojej odpowiedniej przestrzeni, jak opisano dla paciorków powyżej (Eq. 1 ). Błąd średniego położenia jest obliczany na podstawie liczby zebranych fotonów (Nγ), 
Położenie piku Cy5 jest mapowane na kanał Cy3 i obliczana jest odległość między nimi. Po obliczeniowej analizie danych DNA, zidentyfikowane pary fluoroforów zostały przesiane ręcznie, aby upewnić się, że pary nie znajdowały się w pobliżu żadnych innych fluoroforów, które mogłyby zakłócić analizę par.
Dane dotyczące miozyny V zostały przeanalizowane przez pierwszą identyfikację poruszającego się silnika za pomocą oka. Domowej roboty oprogramowanie napisane w matlabie dopasowało następnie wyjściową parę pików fluorescencyjnych do dwuwymiarowych funkcji gaussowskich, jak opisano powyżej, i kontynuowało śledzenie pików tak długo, jak określił to użytkownik. Analizowano silniki, których sprzężone barwniki fotobielały w jednym kroku, jak to miało miejsce w przypadku większości obserwowanych silników, co upewniło nas, że rzeczywiście badamy silniki z tylko jedną etykietą Cy3 i jedną Cy5. Otrzymane trajektorie zostały zarejestrowane przez odwzorowanie trajektorii Cy5 na kanał Cy3. Liniowe dopasowanie najmniejszych kwadratów do punktów z obu trajektorii dało orientację filamentu aktynu, na który trajektorie były rzutowane. Odległości wzdłuż dopasowania liniowego (włókno aktyny) zostały wykreślone względem czasu, aby zobaczyć względne odległości głów (Rys. 4).
Śledzenie w czasie różnie znakowanej cząsteczki miozyny V idącej wzdłuż filamentu aktynowego. Etykiety (Cy3 i Cy5) są kowalencyjnie przyłączone do kalmodulin, które zostały wymienione na cząsteczkę miozyny V. W tym śladzie obie lokalizacje sond fluorescencyjnych wykonują 72-nm kroki, wskazując, że kalmoduliny zostały wymienione w pobliżu domeny motorycznej. Naprzemienne pozycje sond zapewniają bezpośrednią obserwację mechanizmu chodzenia miozyny V ręka w rękę.