Transkrypcja

Transkrypcja

Transkrypcja to przeniesienie informacji genetycznej z DNA do RNA, przy użyciu DNA jako szablonu. Synteza białka zachodzi w rybosomach.

Co to jest gen? Na jednym poziomie, gen jest uporządkowanym ciągiem nukleotydów, który koduje polipeptyd. Takie geny są genami „strukturalnymi”. Wiemy również, że geny mogą również kodować RNA, w tym messenger RNA (mRNA), transferowe RNA (tRNA), rybosomalne RNA (rRNA) oraz inne rodzaje RNA. Ale coś musi włączać i wyłączać ekspresję genu, jak również ją regulować. Sekwencje regulatorowe, które mogą być „promotorami” lub „wzmacniaczami/wyciszaczami” mogą znajdować się z dala od regionów kodujących. Tak więc teraz nasz pogląd na gen musi obejmować ideę oddzielnych regionów chromosomu. A co jeśli informacja zapisana na mRNA nie odzwierciedla końcowego białka, dopóki nie zostanie jeszcze bardziej zmodyfikowana? To jest właśnie „modyfikacja potranskrypcyjna”. Teraz pojęcie genu staje się jeszcze bardziej niejasne. Co się stanie, jeśli regiony kodujące będą się „nakładać”? Najwyraźniej nasza definicja genu nie będzie prosta.

Funkcjonalnie jednak, możemy opisać gen jako posiadający odrębny region kodujący i odrębny region regulatorowy, ten ostatni kontrolujący szybkość, z jaką DNA jest przepisywany na mRNA. Zobaczymy, że jednostki regulacyjne składają się z „motywów” DNA i że każdy motyw będzie musiał być zajęty przez białko regulacyjne, jeśli gen ma być regulowany prawidłowo. Nie tylko musi być odpowiednie przyłączenie białka, ale wszystkie białka muszą pasować do siebie z białkami wiążącymi się z innymi pobliskimi motywami w sposób, w jaki pasują do siebie elementy układanki. I jest tylko jeden poprawny sposób Foreverything do dopasowania razem. Więc, to nie jest tylko prosta sprawa DNA directingmRNA syntezy, który następnie kieruje syntezę białek; białka są intrinsinvolved w regulacji produkcji białek na poziomie transkrypcji.To może dostać się do być koszmarem, jeśli zaczniesz myśleć o regulacji theprodukcji białek regulacyjnych.

Musimy również rozważyć ważną różnicę między eukariota iprokaryota w odniesieniu do transkrypcji strukturalnych, lub białko-kodowanie, geny. U eukariotów geny są transkrybowane pojedynczo, podczas gdy u prokariotów geny o powiązanych funkcjach („operony”) mogą być transkrybowane razem. Na przykład, operon Lac zawiera trzy geny kodujące białka oraz ich sekwencje kontrolne. Operon ten jest transkrybowany jako pojedyncza jednostka jako „policystronowy mRNA”. Eukariotyczne geny strukturalne są transkrybowane jako monocystronowe mRNA.

Synteza RNA ukierunkowana przez DNA

Są trzy etapy charakteryzujące syntezę RNA ukierunkowaną przez DNA:

(1) Inicjacja przez związanie aparatu transkrypcyjnego z szablonem DNA

(2) Wydłużenie łańcucha mRNA

(3) Zakończenie łańcucha mRNA

Część mRNA, która powstaje w wyniku bezpośredniej transkrypcji DNA kodującego „gen”, nazywana jest „transkryptem pierwotnym” i przechodzi modyfikacje, czasem dość rozległe, zanim będzie mogła przetłumaczyć swoje przesłanie na białko.

Klasa enzymów, które syntetyzują RNA są znane jako polimerazy RNA. Są to wielopodjednostkowe kompleksy obecne we wszystkich komórkach, które katalizują reakcję:

(RNA)n-reszty + 1 NTP == (RNA)n+1 reszty + PPi

Pirofosforan jest nieodwracalnie hydrolizowany do 2 Pi, co prowadzi do reakcji w prawo. Poszczególne nukleotydy odczytywane z nici wzorcowej DNA są przepisywane na nukleotydy odpowiedniego RNA, tak więc końcowym rezultatem jest jednoniciowy polimer, czyli mRNA, którego nukleotydy odpowiadają dokładnie komplementarnym nukleotydom na nici DNA z tym wyjątkiem, że wszędzie tam, gdzie w nici wzorcowej DNA pojawia się „A”, w mRNA pojawia się „U”. (MożliweNTP to ATP,CTP,GTP,UTP.)

Transkrypcja u prokariotów

Najlepiej poznaną polimerazą RNA jest polimeraza z E.coli, więc będziemy ją badać jako prototyp polimeraz RNA. Holoenzym jest białkiem o masie 449 kD, składającym się z „enzymu rdzeniowego” i „podjednostki s”, a cały kompleks jest oznaczany jako (rdzeń)s. Enzym rdzeniowy kieruje reakcją polimeryzacji i ma 4 podjednostki: enzym rdzeniowy = a2bb’w. Do aktywności katalitycznej niezbędne są jony nieorganiczne Zn2+ (dwa z nich w podjednostce b’w) i Mg2+, a trójwymiarowa struktura enzymu przypomina dłoń. Kciuk tej ręki może być wyobrażony jako chwytający fragment DNA B, który leży w kanale reprezentowanym przez zakrzywione palce i dłoń. Kanał ten jest cylindryczny, o wymiarach rzędu 25 A na 55 A. Wymiary te pozwalają na zmieszczenie około 16 par zasad B DNA.

Struktura „ręki” pojawia się w innych enzymach, które będziemy badać, w tym w polimerazie DNA i odwrotnej transkryptazie. Możesz dalej badać strukturę dłoni polimerazy RNA patrząc na polimerazę T7 RNA (patrz PDB poniżej).

1ARO: Polimeraza T7 RNA

Patrzymy na transkrypcję z punktu widzenia genu, który, jak już wspomnieliśmy, jest dość niejednoznacznym bytem. Niemniej jednak jasne jest, że musi istnieć punkt wyjścia dla prawidłowej transkrypcji, i rozsądnie jest włączyć go jako część genu, nawet jeśli sam nie ulega transkrypcji. Tak więc problem inicjacji jest tak naprawdę problemem rozpoznania punktu wyjścia. Ale która z dwóch nici DNA służy jako szablon i jak wybiera ją polimeraza?

Każda z tych nici może służyć jako szablon, ale transkrypcja zawsze przebiega od 5′ końca nici DNA do 3′ końca. Nić 3′-5′, która służy jako wzorzec, nazywana jest nicią „antysensowną” lub niekodującą, a nić 5′-3′ (która ma taką samą sekwencję nukleotydów, z wyjątkiem „U” na „T”, jak później transkrybowane mRNA) jest nicią „sensowną” lub „kodującą”. Aby zachować spójność i jasność, będziemy stosować konwencję, że nasz opis pozycji wzdłuż sekwencji nukleotydów będzie z punktu widzenia nici sensu, ponieważ jest to ten sam porządek, co w transkrybowanym mRNA. Część genu, która pełni rolę miejsca inicjacji, nazywana jest „promotorem” i jest poszukiwana przez holoenzym polimerazy RNA. Holoenzym słabo wiąże się z DNA, z Kdissoc wynoszącym około 10-7 M, co pozwala mu przemieszczać się wzdłuż nici antysensowej w poszukiwaniu promotora. Podjednostka ssubunit jest specyficzna dla sekwencji promotorowej i następuje ścisłe wiązanieholoenzymu (Kdissoc około 10-14 M).

Holoenzym polimerazy RNA kontaktuje się z promotorem w przybliżeniu w centrach dwóch regionów (-10 i -35), a enzym rdzeniowy ściśle wiąże się z dupleksowym DNA. Jego działanie polega na topieniu dwuniciowego DNA wzdłuż sekwencji około 11 bps, od -9 do +2. Czynnik s ulega rozszczepieniu i rozpoczyna się transkrypcja.

It is the specific s factors within a cell thatdetermine which genes will be transcribed. Tak więc poszczególne typy komórek są scharakteryzowane przez ich czynniki s.

Elongacja łańcucha przebiega w kierunku 5′–> 3′, a „pęcherzyk transkrypcyjny” (długość „stopionego” DNA) przemieszcza się z polimerazą RNA. W konsekwencji, nieroztopione DNA jest nadbudowywane przed pęcherzykiem i podbudowywane za pęcherzykiem. Topoizomerazy następnie działają w celu rozluźnienia dodatnich i ujemnych superkolejek. Wytworzony mRNA jest hybrydyzowany na krótkiej długości do DNA w pozycji downstream i istnieje oddzielnie od DNA jako „ogon”, którego punkt przyłączenia znajduje się na końcu downstream. Polimeraza RNA nie odpada od DNA w trakcie przetwarzania, ponieważ jej stosunkowo ścisłe, ale niespecyficzne wiązanie po obu stronach pęcherzyka transkrypcyjnego jest stabilizowane przez jej „kciuk” owijający się wokół DNA. Około 20 do 50 nukleotydów jest transkrybowanych na sekundę w temperaturze 37 C, a jeden nukleotyd jest nieprawidłowo transkrybowany na każde 104 . Ponieważ geny są wielokrotnie przepisywane, ten wskaźnik błędu nie jest zbyt szkodliwy, zwłaszcza w połączeniu z faktem, że istnieje wiele kodonów („synonimy”) dla każdego aminokwasu następnie przetłumaczone i żesingle aminokwasów błędy substytucji w białku zazwyczaj nie utrudniają jego funkcji.

Spontaniczne zakończenie transkrypcji genów jest sygnalizowany przez „sekwencje terminacji”.W E.coli, ostateczny sygnał do zatrzymania transkrypcji jest seria 4 – 10 A-T par zasad z Ason na nici szablonu. Dla każdego A w tym regionie, transkrypt mRNA będzie miał U. Tuż przed tą sekwencją znajduje się region bogaty w zasady Gand C, po którym następuje odstęp nukleotydów i inny region bogaty w G i C. Te dwa regiony G,Crich są takie, że jeden region może być nałożony na drugi przez operację asymetrii 180o . Taka relacja par zasad wokół centrum symetrii obrotowej nazywana jest „sekwencją palindromiczną”. Powstały w ten sposób ciąg nukleotydów na 3′ końcu mRNA jest taki, że może powstać pętla spinki do włosów, w której pary zasad Gs łączą się z Cs i odwrotnie, a As z Us. Najbardziej końcowa część 3′ końca to seria Us, po której następuje grupa hydroksylowa. W trakcie tworzenia pętli polimeraza RNA zatrzymuje się w miejscu terminacji. Końcowy ogon oligo-U, który jest tylko słabo związany z nicią szablonu DNA, jest wypierany przez nieszablonową nić DNA.Teraz nić mRNA jest wolna od szablonu DNA. Jednakże, istnieje wiele innych czynników, które wpływają na ogólny proces terminacji.

Nie spontaniczna terminacja transkrypcji wymaga „czynnika rho” białka, które również działa w celu poprawy wydajności spontanicznej terminacji.Czynnik rho rozpoznaje sekwencję na rosnącym łańcuchu mRNA, w górę od miejsca terminacji, po czym przyłącza się i porusza wzdłuż łańcucha w kierunku5′-3′, aż dotrze do polimerazy RNA, która jest wstrzymana w miejscu terminacji. Transkrypt jest uwalniany od swojej nici szablonowej przez rozplatanie dupleksu RNA-DNA przez czynnik rho.

Transkrypcja u eukariontów:

Jakkolwiek bardzo podobna do tej u prokariontów, „maszyneria” i sekwencje kontrolne transkrypcji u eukariontów są znacznie bardziej złożone, a polimerazy RNA są liczne.

Ribosomalne RNA (rRNA) stanowi około 95% całego RNA i około 67% RNA w rybosomach. Reszta RNA obejmuje transferowy RNA (tRNA), posłańczy RNA (mRNA) i inne typy obecne w mniejszych ilościach, takie jak „drobnojądrowe” RNA (snRNA) zaangażowane w splicing mRNA i „przewodnikowe” RNA, które są zaangażowane w edycję RNA. Te dwa ostatnie procesy zachodzą w fazie translacji po DeepL cyklu życiowego eukariotycznego mRNA. Wszystkie RNA są kodowane przez DNA, a różne typy polimerazy RNA u eukariotów odzwierciedlają ten fakt oraz to, że u eukariotów translacja mRNA na DNA zachodzi poza jądrem.

Prekursory większości rRNA są syntetyzowane w nukleolach przy udziale enzymu RNApolimerazy I. Prekursory mRNA są syntetyzowane w nukleoplazmie przez RNApolimerazę II, podczas gdy RNA polimeraza III, również w nukleoplazmie, syntetyzuje prekursory 5S RNA, tRNA i innych RNA występujących zarówno w jądrze, jak i w cytoplazmie. Mitochondria mają swoje własne polimerazy RNA, które są analogiczne do chloroplastowych RNA występujących u roślin. Skupimy się na polimerazie RNA II, ponieważ jest ona zaangażowana w transkrypcję u eukariotów.

Możesz spojrzeć na strukturę drożdżowej polimerazy RNA II (patrz PDB poniżej), gdy omawiamy jej strukturę jako prototypu. Są to duże, wielopodjednostkowe enzymy, przy czym niektóre z podjednostek są homologami podjednostek a, b i b’ w prokariotycznej polimerazie RNA. Ogólny kształt enzymu jest podobny do kształtu prokariotycznej polimerazy RNA (i polimerazy DNA), a mianowicie przypomina dłoń z motywem „kciuka”, która flankuje kanał wystarczająco duży, by pomieścić fragment B-DNA (o szerokości około 25 A).

1ENO: Yeast RNA Polymerase II

Nie rozważaliśmy jeszcze chemii wydłużania łańcucha mRNA, ale zrobimy to tutaj. Łańcuchy są wydłużane w kierunku 5′–> 3′ przez nukleofilowy atak grupy 3′ OH rosnącego łańcucha na a-fosforan z przychodzącego NTP.

Tak jak u prokariotów, transkrypcja u eukariotów rozpoczyna się od rozpoznania promotorów. Istnieje wiele kopii genów rRNA, które kierują syntezą rRNA, wszystkie o niemal identycznych sekwencjach. Ta nadmiarowość zapewnia odpowiednią podaż rRNA, które, jak już wspomnieliśmy, stanowi około 95% komórkowego RNA. Promotory dla tych prawie identycznych genów są zatem identyczne, więc RNApolimeraza I musi rozpoznać tylko jedną sekwencję promotora. Jednakże, RNApolimeraza I jest gatunkowo specyficzna (RNA poly II i III nie są gatunkowo specyficzne).

Dla promocji rRNA ssaków, istnieje „rdzeń elementu promotorowego”, który obejmuje region -31 do +6 (zauważcie, że pokrywa się to z regionem genu, który jest transkrybowany) i „element promotorowy upstream”, który obejmuje -187 do -107.

W przypadku transkrypcji genów przez polimerazę RNA III, promotor jest czasami umiejscowiony w segmencie wewnątrz transkrybowanej części genu, pomiędzy +40 i +80, ale może być także częściowo w górę rzeki lub całkowicie w górę rzeki od miejsca startu.

Sekwencje promotorowe i kontrolne polimerazy RNA II

Sekwencje promotorowe dla polimerazy RNA II są zróżnicowane. Możemy je podzielić na dwie klasy: te, które znajdują się w genach produkujących białka w takim samym tempie we wszystkich komórkach („enzymy konstytutywne”) i te dla genów, których tempo produkcji różni się znacznie w zależności od typu komórki i zależy od potrzeb zróżnicowanej komórki w danym czasie („enzymy indukowalne”).

Elementy konstytutywnego promotora genu:

Pole GC : Jest to region zawierający jedną lub więcej kopii sekwencji GGGCGG (lub jej dopełnienia) w miejscu upstream od miejsca startu, i jest analogiczny do elementów promotora prokariotycznego.

Inne elementy promotorowe znajdują się również w regionie od -50 do – 110, powyżej pola GC.

Elementy promotorowe selektywnie ekspresjonowanych genów:

Pole TATA: obszar zlokalizowany na poziomie od -25 do -30, bogaty w nukleotydy „A” i „T” i przypominający pole Pribnow (TATAAT). Geny mogą być nadal transkrybowane w obecności uszkodzonego pola TATA i uważa się, że pole TATA jest zaangażowane w wybór miejsca startu transkrypcji

Pole CCAAT : Jest to sekwencja, która często znajduje się przed polem TATA, zlokalizowana na około -70 do-90. Wiążą one polimerazę RNA II, jak również inne białka potrzebne do zapoczątkowania transkrypcji.

Sekwencje kontrolne dla genów strukturalnych:

Inne regiony chromosomu, niektóre znacznie oddalone od miejsca startu, mogą wpływać na wiązanie polimerazy RNA II do elementów promotorowych. Te elementy genowe nazywane są „enhancerami” i „silencerami”. Białka zwane „aktywatorami” i „represorami” mogą wiązać się do enhancerów i silencerów, wpływając w ten sposób na wiązanie polimerazy do promotorów. Co więcej, to samo białko może działać zarówno jako aktywator, jak i represor, w zależności od specyficznej interakcji („podwójnie działające” czynniki transkrypcyjne).

Rekrutacja polimerazy RNA II do promotora:

Eukarionty nie mają prostego białka, które odpowiada czynnikowi sf u prokariotów. Istnieje raczej zestaw białek, które razem pełnią tę samą funkcję, co czynnik s, a są to „ogólne czynniki transkrypcyjne” („GTF”). Strukturom czynników transkrypcyjnych przyjrzeliśmy się już przy okazji omawiania interakcji DNA-białko w poprzednim wykładzie. Poza tym, ogólne mechanizmy inicjacji transkrypcji są podobne.

Istnieje 6 GTF-ów, które są wymagane dla niskiej i niezmiennej podstawowej szybkości transkrypcji, a szybkość ta może być zwiększona przez udział innych czynników białkowych. Te GTF-y tworzą „kompleks preinicjacyjny”, który rozpoczyna się, gdy „białko wiążące TATA” („TBP”) wiąże się do pola TATA (jeśli takie istnieje) promotora. Specyficzna sekwencja, do której się ono wiąże, identyfikuje miejsce startu transkrypcji. W wyniku tego wiązania DNA zostaje zniekształcone przez zagięcia na obu końcach ramki TATA. Inne GTFs wiążą się kolejno, po czym następuje wiązanie polimerazy RNA. W końcu wiążą się pozostałe GTFy.

1YTB: TBP/TATA Box Complex

Po związaniu TBP (który jest składnikiem TFIID), sekwencja wiązania jest następująca:

TFIIA

TFIIB

TFIIF

RNA PII

TFIIE

TFIIH

TFIIH ma dwie ważne aktywności enzymatyczne. Pierwsza z nich to zależna od ATP aktywność helikazy, która wspomaga tworzenie otwartego kompleksu, a druga to aktywność kinazy, która powoduje fosforylację największej podjednostki polimerazy RNA II na jej C-końcowym końcu. Teraz może rozpocząć się proces wydłużania transkrypcji, przy czym różne GTF (z wyjątkiem TFIIF) odłączają się od kompleksu w miarę wydłużania. TFIID pozostaje związany z promotorem, tak że powtórzona transkrypcja może wystąpić jako GTFs reassemble do tworzenia preinicjacjicomplex.

Ta dyskusja skupiła się na polimerazie RNA II; różne czynniki transkrypcji są potrzebne dla polimerazy RNA I i III. Jednak wszystkie trzy wymagają TBP.

Komórki kontrolują transkrypcję każdego genu indywidualnie. Unikalna kombinacja tłumików i wzmacniaczy dla każdego genu moduluje tempo transkrypcji. W jaki sposób białka aktywatora i represora, które są związane z dala od promotora, wpływają na transkrypcję genów?

„Białko specyficzności 1” (Sp1) było pierwszym znalezionym czynnikiem transkrypcyjnym, który mógł rozpoznać specyficzną sekwencję GC regulującego enhancera. Białko to ma dwa interesujące moduły:

(1) moduł 3 palców cynkowych na jednym końcu;

(2) moduł na przeciwległym końcu z 2 dyskretnymi segmentami bogatymi w Gln.

Mutanty, które nie mają końca bogatego w glutaminę mogą wiązać się z DNA, ale transkrypcja nie jest stymulowana. Dlatego też koniec bogaty w glutaminę musi wiązać się z czymś innym, aby transkrypcja mogła zachodzić, i to są właśnie „koaktywatory”. Nazywane są one również „TBP-Assicuated Factors” lub „TAFs” i jest ich co najmniej osiem, które są ważne dla aktywacji transkrypcji. Nie są to czynniki bazalne (GTF) i nie wiążą się do specyficznych sekwencji DNA. Wiążą się one raczej z TBP i zapewniają liczne „miejsca dokowania” dla aktywatorów. W tym sensie są one „molekułami adaptorowymi”. Zestaw narzędzi” takich cząsteczek adaptorowych zapewnia ogromną różnorodność opcji modulowania transkrypcji agenu. Tak więc, rozwijając nasze poprzednie porównanie kompleksu preinicjacyjnego GTF do prokariotycznego czynnika s, lepszym porównaniem byłoby porównanie czynnika s do całego kompleksu aktywator – koaktywator – podstawowy kompleks preinicjacyjny. Jeśli chodzi o to, jak ten układ moduluje lub wpływa na tempo transkrypcji, to prawdopodobnie pośredniczy w tym przede wszystkim zniekształcenie DNA, które ułatwia ruch polimerazy RNA II wzdłuż regionu kodującego.

Latchman (TRENDS in Biochemical Sciences Vol. 26 No.4 April 2001) zwrócił uwagę na znaczenie samego miejsca wi±zania DNA jako odgrywaj±cego kluczow± rolę w modulacji transkrypcyjnej. Ten sam czynnik transkrypcyjny może przybierać różne konformacje w wyniku wi±zania się z różnymi miejscami. Zmiany konformacyjne są indukowane przez interakcję DNA-białko, co zwiększa elastyczność spektrum kontroli transkrypcji, ponieważ jedno białko może działać jak cały zbiór białek, z których każde ma swój własny efekt (aktywacja, inhibicja lub brak efektu).

Aby przenieść to o krok dalej, można sobie wyobrazić, że podobne zjawisko może wystąpić, gdy koaktywatory wiążą się z aktywatorami. Być może różne zmiany konformacyjne są podobnie indukowane w związanym białku w zależności od typu interakcji białko-białko. Such conformational changes can then result indifferent ability to modulate transcription.

The activation domains of transcription factors are often glutamine-rich, butothers are proline-rich or acidic. W niektórych przypadkach, hydrofobowe reszty sąinterspersed wśród kwasowych lub glutaminowych pozostałości i są ważne dla aktywacji. Tjian (Cell, Vol. 77, 5-8, April 8, 1994) sugeruje, że siły hydrofobowe napędzają kohezję domen aktywacyjnych z ich celami i że specyficzność jest osiągana przez okresowość elementów kohezyjnych.

Geny są transkrybowane z mierzalną szybkością tylko wtedy, gdy właściwe aktywatory są obecne i są w stanie przezwyciężyć efekty represorów.

.