Patogénese In Vitro
Células epiteliais colunares são células sem saída que experimentam dois extremos de pH ao mesmo tempo. Apicamente, elas são banhadas em fluidos intestinais altamente alcalinos e basicamente são banhadas em hemolinfa ligeiramente ácida. Estas condições são difíceis de imitar em cultura celular, fato que pode explicar a escassez de informação disponível sobre infecção primária.
Linhas de células que suportam replicação GV são raras e atualmente só existem para CpGV. Consequentemente, nós sabemos pouco mais sobre mecanismos de infecção por GV do que sabemos sobre a infecção por ODV. Mesmo assim, sabemos que durante a morfogênese nucleocapsidar do GV, a membrana nuclear da célula hospedeira se desintegra, um evento que não interrompe o processamento da nucleocapsidar. O desaparecimento da membrana nuclear é distinto e não ocorre nas células hospedeiras infectadas pelo VNP.
Foi estabelecido um número de linhas de células de insetos que suportam infecções pelo VNP. A maioria das linhas celulares são derivadas de ovários ou embriões de lagartas. O AcMNPV pode se replicar em linhas celulares derivadas de várias espécies de insetos, fato que contribui para que seja o baculovírus mais bem estudado. Em uma curva de crescimento padrão de uma etapa, os AcMNPV BVs normalmente são produzidos 12-20 h após a infecção (hpi), e oclusões, 20-48 hpi. A replicação da maioria dos outros NPVs em cultura celular leva horas a dias a mais.
AcMNPV BV é 1000 vezes mais infecciosa que o ODV, principalmente devido à presença de sua proteína de fusão, GP64. BVs entram em suas células alvo através da endocitose mediada por clathrina. As nucleocapsids BV penetram profundamente no citoplasma das células alvo, sendo liberadas a partir de endossomos. Usando esta estratégia, os nucleocápsicos contornam o ambiente possivelmente perigoso que fica logo abaixo da membrana plasmática e entram na célula mais próxima do núcleo do que a fusão na membrana plasmática permitiria. As mudanças conformacionais sensíveis ao pH experimentadas pelas proteínas de fusão BV servem para desencadear um evento de fusão entre o envelope viral e a membrana endossômica.
AcMNPV nucleocapsids escape do endossomo é imediatamente seguido por sua associação com os cabos F-actin. A formação de cabos é transitória, e ocorre durante o tempo em que os nucleocápsides virais se movem para o núcleo e entram no mesmo. Durante o trânsito, as nucleocápsides virais co-localizam-se com uma extremidade de um cabo de actina, possivelmente via P78/83, uma proteína F-actin-binding protein que se pensa estar localizada na base das nucleocápsides. A associação das nucleocápsides com cabos de F-actin e o atraso da expressão do gene repórter na presença de drogas que perturbam a função actina/miosina sugerem que os cabos podem facilitar o transporte das nucleocápsides para o núcleo, ou mediar sua passagem através de poros nucleares.
NPV e algumas nucleocápsides do GV entram nos núcleos através de poros nucleares. Alguns GVs desbotam nos poros nucleares, mas a maioria dos baculovírus desbotam dentro do núcleo. A transcrição precoce do gene começa imediatamente, mediada pelo hospedeiro RNA polimerase II (Pol II). Entre os genes precoces expressos está um subconjunto cuja expressão leva ao transporte eficiente de G-actin para e acumulação dentro do núcleo (Figura 5). Esta manipulação espetacular da localização da actina é crítica para a produção de descendência do VNP e não foi descrita para nenhum outro patógeno. Os genes envolvidos na localização nuclear da actina, identificados em experimentos transitórios de transfecção, incluem ie1, pe38, Ac004, Ac152, he65, e Ac102. Dois dos genes, ie1 e Ac102, são conservados entre todos os VNP e VG lepidópteros, e ambos são essenciais.
Figure 5. G-actin nuclear em células infectadas com AcMNPV. (a) 4′,6-Diamidino-2-fenilindole (DAPI)-células infectadas; (b) célula infectada expressando proteína verde fluorescente transfectada (GFP)-actin. (c) A ausência de coloração de rodamina phalloidin nuclear indica que a actina nuclear é monomérica.
Transição para o estágio tardio da infecção é o início do período de produção da prole BV; as atividades celulares são orientadas para sintetizar componentes virais em taxas máximas, reunindo-os em produtos nucleocápsicos e depois exportando-os. A síntese macromolecular hospedeira é interrompida durante este período, mas a estrutura da cromatina hospedeira permanece intacta até a morte da célula. Os genes virais tardios e muito tardios são expressos por uma RNA polimerase codificada pelo vírus.
Microtubules, reorganizados durante a fase inicial da infecção, são despolimerizados por fatores produzidos durante a fase tardia levando ao arredondamento celular (Figura 6). Da mesma forma, G-actin, acumulada dentro do núcleo durante a fase inicial, polimeriza durante a fase tardia, concomitantemente com o inchaço nuclear e desaparecimento das estruturas nucleares do hospedeiro visível (Figura 7). O estroma virogênico, local de síntese do DNA viral, forma-se no centro do núcleo e é intercalado e cercado por uma zona de electrões-lucentes chamada “zona anelar”, um local onde as cápsulas são montadas e amarradas durante a carga do genoma. O F-actin nuclear co-localiza-se com a proteína principal do capsids AcMNPV na zona anelar (Figura 7).
Figure 6. Células Sf21 infectadas com AcMNPV demonstrando diferentes fases do efeito citopático (CPE). (a) Células não infectadas. Observar a forma do fuso e a presença de estruturas nucleocromatinosas. (b) Células infectadas com AcMNPV mostrando efeito citopático precoce e tardio. As células são arredondadas devido a microtubos despolimerizantes, os núcleos são maiores e livres de estruturas hospedeiras, e o estroma virogênico (vs) é circundado por zona anelar (rz). Os estroma viogênicos tornam-se mais densos à medida que o estágio tardio de infecção progride. Os poliedros enchem o núcleo durante o estágio muito tardio da infecção (p).
Figure 7. F-actin nuclear na célula infectada pelo AcMNPV durante a expressão tardia do gene. (a) A coloração DAPI indica a localização do núcleo. (b) A fluorescência verde indica que a proteína capsid está localizada principalmente na zona do anel do núcleo. (c) A coloração da faloidina da rodamina mostra que a F-actin co-localiza com o capsido na zona anelar.
F-actino F-nuclear é necessário para a produção de BV. Na presença de F-actin-disruptor, os capsidos virais são malformados e aparecem como estruturas tubulares longas justapostas à membrana nuclear interna com manchas pouco freqüentes de material denso de elétrons. As placas de base e as estruturas das cápsulas normalmente presentes não são evidentes, e um excesso de perfis membranosos é produzido. A síntese de DNA viral ocorre na taxa normal mas os genomas não são embalados e o estroma virogênico tem uma aparência “relaxada” em comparação com o estroma normal. Curiosamente, o fenótipo para a ausência do AcMNPV fator-1 muito tardio (VLF-1) é similar, sugerindo que o VLF-1 pode estar envolvido na amarração das cápsulas ao estroma virogênico, e que a F-actin é um componente do estroma ao qual as cápsulas estão ligadas, direta ou indiretamente.
P78/83, uma proteína de cápsula menor expressa tardiamente durante a infecção, é essencial para a viabilidade do AcMNPV. Esta característica foi observada há mais de 30 anos e explorada nos primeiros kits de expressão comercial de baculovírus. P78/83 (78 kDa quando não fosforilado e 83 kDa quando fosforilado) é considerado como fazendo parte das placas de base tanto do BV como do ODV capsids. P78/83 é uma proteína de ligação F-actin, e esta atividade pode ajudar a amarrar as capsids à matriz nuclear durante a montagem. Curiosamente, P78/83 contém outra atividade que explica porque ela é essencial; ela promove a polimerização da actina dentro do núcleo. P78/83 contém domínios conservados nos membros da família das proteínas da síndrome de Wiskott-Aldrich (WASP), fatores que promovem a nucleação dos filamentos de actina. Os membros da família WASP regulam positivamente a atividade actina-nucleante do complexo proteína relacionada à actina (Arp)-2/3. O complexo de sete subunidades, conservado em eucariotas, é translocado para o núcleo em células infectadas por AcMNPV e é ativado por P78/83. Mutações em P78/83 que levam à diminuição da capacidade de promover a nucleação de actina de forma correspondente levam à diminuição da capacidade de produzir BV infecciosa.
Imediatamente após a entrada no núcleo, o DNA AcMNPV adopta uma estrutura semelhante à dos nucleossomas e utiliza nucleosomas e processos relacionados com os nucleossomas na replicação do genoma. Um componente da estratégia de replicação viral, portanto, parece estar seqüestrando componentes, se não toda a capacidade de remodelação da cromatina hospedeira. Evidências recentes sugerem que a família de proteínas BRO (baculovírus repetidos ouf) são provavelmente participantes neste processo. As proteínas BRO são expressas precocemente durante a infecção, ligam o DNA de cadeia única (ssDNA) e os histones centrais, e dividem com os histones em experimentos de fracionamento. BmNPV, orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus, e lymantria dispara nucleopolyhedrovirus multiple nucleopolyhedrovirus todos têm múltiplos genes de broto. AcMNPV carrega apenas um gene de bro, relacionado ao BmNPV bro-d, que é essencial.
AcMNPV-encoded P6.9, a proteína altamente básica do empacotamento do genoma, começa a se acumular durante o estágio tardio da infecção e uma estrutura alternada de cromatina emerge.
As interações P6.9-DNA são controladas pelo estado de fosforilação de P6.9. Durante a embalagem do genoma, o DNA genômico do estroma virogênico se liga com P6.9, pois o P6.9 é desfosforado, condensando em uma bainha pré-formada através de uma abertura em uma estrutura cônica final. As estruturas cônicas ficam proximais ao estroma virogênico com bainhas capsidas cobertas por placas de base que se estendem distalmente para um espaço menos denso de elétrons, a zona do anel. F-actin e capsid protein co-localizam-se na zona do anel, juntamente com o complexo P78/83 e Arp2/3. É esta fase de replicação que é afetada tanto pelas drogas que perturbam a F-actin e a ausência de VLF-1.
Com o início da fase muito tardia da infecção há uma redução na produção de VLF e há um início da produção de ODV. Os nucleocapítulos recentemente montados ficam dentro do núcleo, onde são envoltos em envelopes que se pensa serem derivados da membrana nuclear interna. Os viriões envelopados, mas não os nucleocápsicos não desdobrados, tornam-se ocluídos numa matriz proteica para formar cápsulas ou poliedros. As células acabam por se ocluir, libertando oclusões no meio.