Materiais e Métodos
Preparação de DNA Duplex. Para fazer as moléculas de DNA duplex 30-bp, dois oligonucleotídeos com a seguinte sequência e modificações foram hibridizados (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). O oligonucleotídeo 5′-GGGTATGGAGATTTTTAGCGGAGTGACAGC-3′ foi rotulado com Cy5 no seu extremo 5′ e com Cy3 no seu extremo 3′. O oligonucleotídeo complementar foi rotulado com biotina em ambas as extremidades.
Expressão e Purificação de Proteínas. O gene da proteína fluorescente amarela (YFP) no plasmídeo p2Bac/pFastBac-YFP-M5-CaM (um presente de H. Lee Sweeney, University of Pennsylvania, Philadelphia) foi eliminado por PCR. Os códigos do plasmídeo p2Bac/pFastBac-M5-CaM resultante para a miosina V de frango que é truncada em Glu-1099. Um zíper de leucina seguiu a bobina enrolada nativa para garantir a dimerização. Para facilitar a purificação, a proteína myosin V foi N-terminalmente marcada com uma etiqueta FLAG (DYKDDDDK). Dois baculovírus recombinantes foram gerados para expressão da proteína nas células Sf9. Um codificou a miosina V truncada e a Drosophila melanogaster calmodulin derivada do plasmídeo p2Bac/pFastBac-M5-CaM. O segundo vírus codificou a cadeia de luz essencial humana derivada do plasmídeo p2Bac/pFastBac-ELC. Ambos os vírus foram utilizados para a coinfecção das células Sf9. A proteína foi expressa e purificada como descrito por Sweeney et al. (20).
Calmodulin Labeling and Exchange. A Calmodulin foi expressa e rotulada com Cy3 ou Cy5 como se segue: Uma única cisteína foi introduzida na calmodulin de ouriço-do-mar por meio da mutação Q143C. Esta calmodulina foi expressa em Escherichia coli e purificada como descrito na ref. 21. A calmodulin foi rotulada com soluções de estoque de Cy3-maleimida ou Cy5-maleimida (Amersham Biosciences) (em DMSO) a uma razão molar de 1,4 vezes durante 20 min. O excesso de corante foi removido por filtração de gel em tampão de troca (abaixo), seguido por absorção hidrofóbica noturna em BioBeads (Bio-Rad). A incorporação do rótulo foi de 102% para a Cy3-calmodulin e 75% para a Cy5-calmodulin. As alíquotas foram armazenadas a -80°C.
A troca de calmodulin rotulado em myosin V foi realizada como descrito, mas com algumas modificações (22). A miosina V (150 nM) foi incubada com calmodulin marcado com 0,7 nM Cy3 e calmodulin marcado com 0,8 nM Cy5 em tampão de troca (25 mM KCl/20 mM imidazole HCl, pH 7,4/2 mM MgCl2/1 mM EGTA) a 22°C durante 2 min. Para a troca de calmodulinas, foi adicionado 0,9 mM CaCl2 e a mistura foi incubada a 22°C durante 5 min. A reacção foi atenuada com 7 mM EGTA. A mistura de reação foi aplicada em um dispositivo de ultrafiltração 100K MWCO Nanocep (Pall) e lavada três vezes com volumes iguais de AB (abaixo) para purificar a miosina V do excesso de calmodulinas.
Flow Cell Preparation. A célula de fluxo foi construída com uma lâmina de microscópio de vidro e lamelas altamente refractárias feitas de NLAF21 (VA Optical Labs, San Anselmo, CA) mantidas juntas por pedaços de fita adesiva de dupla face.
Para as experiências com miosina V, 15 μl de biotina-BSA (1 mg-ml-1) foi incubada na célula de fluxo durante 2 min, após o que 30 μl de tampão AB (25 mM KCl/25 mM imidazole HCl, pH 7.4/1 mM EGTA/4 mM MgCl2/10 mM DTT/1 mg-ml-1 BSA) foi passado através da célula de fluxo para lavá-la. Quinze microlitros de 0,5 mg/ml de NeutrAvidina (Sondas Moleculares) foram adicionados à célula e foi permitida a incubação por 2 min, após o que outra lavagem foi feita com tampão AB. A célula de fluxo foi incubada com 15 μl de filamentos de falloidina actina biotinizada (250 nM) durante 5 min, seguido de uma lavagem de 100-μl com tampão AB. Finalmente, a célula foi carregada com 20 μl de tampão de imagem incluindo miosina V trocada por calmodulin, 5 μM calmodulin, 300 nM ATP, um sistema de regeneração ATP (0,1 mg-ml-1 creatine phosphokinase/1 mM creatine phosphate), e 0,5% (vol/vol) Triton-X 100 para reduzir a ligação inespecífica. A célula foi selada com graxa a vácuo e imersa imediatamente. A concentração motora final resultou em actina esparsamente decorada e assim permitiu uma análise de moléculas únicas de miosina V.
Para os experimentos de DNA, a biotina-BSA e NeutrAvidina foram carregadas da mesma forma que para os experimentos de miosina V, mas as lavagens foram feitas com tampão T50 (10 mM Tris, pH 8.0/50 mM NaCl). Uma vez que a célula de fluxo teve um revestimento de NeutrAvidina, 15 μlof dsDNA (30 nM) em tampão T50 com 1 mg-ml-1 de BSA foram fluidos e incubados durante 2 min, após o que 100 μl de tampão de imagem foram fluidos. A célula de fluxo foi então selada com graxa a vácuo e imediatamente imersa. A decoração resultante das moléculas de DNA na superfície foi suficientemente esparsa para que manchas fluorescentes de diferentes moléculas raramente se sobrepusessem.
Microscópio Setup. O microscópio de reflexão interna total de fluorescência (TIRF) foi configurado como descrito na ref. 8, com algumas modificações (Fig. 5, que é publicada como informação de suporte no site da PNAS). Feixes de fonte de excitação a 532 nm (Coherent, Santa Clara, CA) e 633 nm (JDS Uniphase, San Jose, CA) foram combinados por um espelho dicróico e expandidos para um diâmetro de 7 mm. Estas fontes foram focalizadas (distância focal = 500 mm) no plano focal posterior de uma objectiva Olympus 1,65 NA × 100 TIRF, através de uma linha laser dicróica numa tradução linear DeepL que permite a operação do microscópio nos modos epifluorescência ou TIRF. A objetiva foi posicionada sob uma translação piezo nanoDeepL em ciclo fechado, de dois eixos, equipada com sensores capacitivos para medição de posição (Physik Instrumente, Auburn, MA). A luz refletida que sai da abertura traseira da objetiva foi direcionada em um fotodiodo quadrante para fornecer um sinal para um loop de realimentação de foco que fixou a distância entre a objetiva e a amostra com um atuador eletrostático (Newport, Fountain Valley, CA). A emissão de fluorescência foi coletada pela objetiva, passada por dois filtros StopLine de entalhes de filme fino (Semrock, Rochester, NY), um para cada fonte de excitação, e transmitida através de um aparelho de dupla visão que permitiu a imagem simultânea dos canais Cy3 e Cy5 em uma única câmera iXon DV 887 EMCCD (Andor Technology, Belfast, Irlanda). Todos os dados foram imitados com um tempo de integração de 0,5 segundos. A oscilação entre os dois canais (10%) supostamente enviesou as medidas de distância para valores menores. Nosso erro experimental, no entanto, torna-o indetectável, como mostram as simulações de Monte Carlo em que 100 pares de imagens modeladas de fluoróforos simples separados por 10 nm foram criados e analisados identicamente como com os dados de DNA (descritos abaixo). As imagens simuladas das funções de propagação de pontos fluorescentes foram calculadas gerando uma distribuição de intensidade Gaussiana 2D integrada com um fundo constante ao qual foi adicionado o ruído de disparo. Os picos simulados tinham as mesmas dimensões e relação sinal/ruído que os picos reais. Dados simulados com 10% de crosstalk e dados simulados sem crosstalk são indistinguíveis por um teste Kolmogorov-Smirnov (N 1 = 100, N 2 = 100, p > 0,05).
Análise de dados. Um mapeamento de registro dos canais Cy3 e Cy5 foi realizado com fiduciais compostos por contas transFluoSphere de 100 nm (Sondas Moleculares). Elas foram excitadas a 532 nm, e emitem com um amplo espectro de emissão. O grânulo foi detectável em ambos os nossos canais. Localizamos um único grânulo associado à lamela, e com nosso estágio piezoelétrico o pisamos com precisão nanométrica em um padrão de grade (com espaçamento 0,5-μm), obtendo uma imagem em cada parada. O resultado final foi uma pilha de 312 imagens que mostra o talão em ambos os canais em diferentes posições (Fig. 1a ).
Os dados de DNA foram analisados por software caseiro usando matlab (Mathworks, Natick, MA). A rotina localiza automaticamente os picos na imagem determinando os pixels de alta intensidade e garante que os pixels ao redor tenham a intensidade esperada para um único fluoróforo. Antes de ajustar os picos a uma função Gaussiana 2D para obter suas localizações centrais, nós procuramos por pares de picos. Os pixels encontrados no canal Cy5 são mapeados no canal Cy3, e uma busca por picos nos pixels circundantes do Cy3 é realizada. Se um pico é encontrado, então o pico Cy5 e o pico Cy3 são considerados um par para análise posterior. Cada pico é ajustado a uma função Gaussiana 2D em seu respectivo espaço, como descrito para os grânulos acima (Eq. 1 ). O erro na localização da média de ajuste é calculado com o número de fotões (Nγ) recolhidos, 
A localização do Cy5 é mapeada para o canal Cy3, e a distância entre eles é calculada. Após a análise computacional dos dados de DNA, os pares de fluoróforos identificados foram analisados manualmente para assegurar que os pares não estivessem próximos a nenhum outro fluoróforo que interferisse na análise dos pares.
Os dados de myosin V foram analisados identificando primeiro um motor em movimento a olho. O software caseiro escrito em matlab então encaixa o par inicial de picos fluorescentes nas funções Gaussianas 2D como descrito acima e continua a rastrear os picos pelo tempo que o usuário especificar. Foram analisados motores cujos conjugados tingem cada fotocélula em uma única etapa, como foi o caso da maioria dos motores observados, o que garantiu que estávamos estudando motores com apenas uma etiqueta Cy3 e uma Cy5. As trajetórias resultantes foram registradas mapeando a trajetória do Cy5 no canal Cy3. Um mínimo de quadrados de ajuste linear aos pontos de ambas as trajetórias deu a orientação do filamento de actin para o qual as trajetórias foram projetadas. As distâncias ao longo do ajuste linear (o filamento de actina) foram traçadas contra o tempo para ver as distâncias relativas das cabeças (Fig. 4).
Traço temporal de uma molécula de miosina V com rótulos diferentes caminhando ao longo de um filamento de actina. As etiquetas (Cy3 e Cy5) são covalentemente fixadas às calmodulinas que foram trocadas pela molécula de miosina V. Neste traço, ambas as localizações da sonda fluorescente estão dando passos de 72 nm, indicando que as calmodulinas foram trocadas perto do domínio motor. As posições alternadas das sondas fornecem uma observação direta do mecanismo de andar de mão sobre mão da miosina V.