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O PROMÍSSIMO DAS TERAPIAS MELHORADAS ATRAVÉS DE ESTUDOS MOLECULARES DE HEMOGLOBINA FETAL

Embora as abordagens terapêuticas não direcionadas discutidas acima tenham demonstrado promessa e algum sucesso na indução da HbF em ambientes clínicos, Uma melhor compreensão mecanicista dos fundamentos moleculares necessários para o comutador de hemoglobina fetal-adulto normal é uma grande promessa para permitir abordagens mais eficazes e especificamente orientadas para a indução de HbF. Nas décadas seguintes à clonagem molecular dos genes da globina, foram identificados vários fatores de transcrição que desempenharam papéis na regulação gênica da globina (Cantor e Orkin 2002). Isto incluiu fatores de transcrição como GATA1, KLF1, e SCL/ TAL1. Entretanto, o estudo do papel desses fatores na regulação gênica da globina foi confundido pelo amplo papel desses fatores na diferenciação e seus papéis pleiotrópicos como reguladores da regulação gênica da globina e do eritróide. Nenhum desses fatores pareceu ser regulador específico do interruptor hemoglobina fetal-adulto. Levou quase três décadas desde a clonagem inicial dos genes da globina até que reguladores específicos desse processo fossem identificados.

Pistas importantes sobre a identidade desses fatores surgiram do estudo da variação genética humana natural. Vários grupos buscaram a base para a variação genética comum nos níveis de HbF usando tanto estudos de associação de alvo como de genoma (GWAS) (Menzel et al. 2007; Thein et al. 2007; Lettre et al. 2008; Uda et al. 2008). Estes estudos resultaram na identificação de três loci genómicos que abrigam variantes comuns que influenciaram os níveis de HbF. Isto incluiu uma região do cromossoma 2 dentro do gene BCL11A, uma região intergênica entre os genes HBS1L e MYB no cromossoma 6, e variantes dentro do locus β-globin locus no cromossoma 11. Estudos recentes que mapearam mais finamente estas variantes genéticas sugerem que >50% da variação nos níveis de HbF podem ser explicados pela variação comum nestes três loci (Galarneau et al. 2010). Embora se pense que os níveis de HbF tenham um componente genético hereditário na faixa de 5% em ∼80, é importante ter em mente que a variação genética aditiva encontrada a partir de variantes genéticas comuns ignora potenciais interações genéticas de ordem superior que podem não ser detectadas e, portanto, a medida em que os níveis de HbF são determinados geneticamente permanece por explorar em estudos futuros (Zuk et al. 2012).

A observação inicial de variantes associadas a níveis de HbF dentro do fator de transcrição de zinco-dedo BCL11A levou a um estudo inicial que perseguiu a hipótese de que o BCL11A pode ser um regulador da expressão de HbF (Sankaran et al. 2008). Trabalhos anteriores haviam sugerido que o BCL11A era um regulador transcripcional crítico envolvido na linfoiese B e na neurogênese (Sankaran et al. 2010). Os níveis de proteína BCL11A pareciam correlacionar com o estágio de desenvolvimento da expressão, de modo que as células eritróides primitivas e fetais definitivas do fígado que expressavam altos níveis de γ-globina, tinham expressão baixa ou ausente das formas integrais de BCL11A. Este resultado sugeriu que este produto genético estava agindo como um repressor dos genes da γ-globina. Para testar isso diretamente, foi realizado um knockdown de BCL11A usando abordagens de RNA (shRNA) de cadeia curta em progenitores eritróides adultos primários e a expressão de γ-globina poderia ser induzida de forma robusta em tal knockdown. O grau de indução do γ-globina pareceu estar relacionado com a extensão do knockdown do BCL11A. Curiosamente, grandes perturbações na eritropoiese não pareciam ocorrer apesar da robusta indução da γ-globina observada. Estudos de acompanhamento mostraram resultados semelhantes ao derrubar a expressão do BCL11A usando shRNAs (Borg et al. 2010; Zhou et al. 2010; Wilber et al. 2011). Foi também demonstrado que o BCL11A interage diretamente com a cromatina no locus humano β-globin em células eritróides primárias e que parece atuar como parte de um complexo com o fator de transcrição GATA1 e o complexo repressor e remodelador da cromatina NuRD (Sankaran et al. 2008). De interesse, o complexo NuRD contém os HDACs 1 e 2, que foram sugeridos como sendo os HDACs críticos necessários para o silenciamento de HbF (Bradner et al. 2010). Além disso, foi sugerido que o fator de transcrição SOX6 pode cooperar com o BCL11A para ajudar a silenciar os genes da globina γ em humanos e pode ser essencial para ligar o promotor proximal desses genes da globina (Xu et al. 2010).

Embora a comutação da hemoglobina em modelos de camundongos, mesmo aqueles que abrigam um locus transgene humano β-globin, pareça divergir da ontogenia normal da expressão da globina vista em humanos, um papel evolutivamente conservado do BCL11A no silenciamento e comutação do gene da globina foi mostrado em camundongos (Sankaran et al. 2009; McGrath et al. 2011). Ratos sem BCL11A parecem ter eritropoiese normal, mas não conseguem silenciar completamente os genes embrionários da globina em células eritróides definitivas e permitem alguma expressão persistente da γ-globina quando o locus humano intacto β-globina está presente. Estas descobertas reforçam a importância da BCL11A como mediador crítico da mudança da globina em mamíferos. Embora este estudo inicial tenha abordado o papel do BCL11A no processo de desenvolvimento da comutação da globina em ratos (Sankaran et al. 2009), um estudo mais recente utilizou a inativação condicional do BCL11A para mostrar que a inativação induzível pode resultar em extensões robustas e similares da indução do gene γ-globina como ocorre quando a inativação ocorre em pontos de tempo anteriores (Xu et al. 2011). Além disso, embora haja regulação diferencial dos genes da globina entre humanos e ratos, a inativação do BCL11A mostrou-se suficiente para melhorar as características hematológicas e patológicas observadas em modelos de camundongos com doença falciforme, fornecendo uma importante prova de princípio para a potencial eficácia de visar o BCL11A para induzir HbF (Xu et al. 2011).

Os mecanismos exatos pelos quais o BCL11A silencia γ-globina expressão gênica permanece pouco clara. Um estudo recente sugere que isto pode ser mediado tanto através de interações com fatores de transcrição, como SOX6 que ligam a cromatina nos promotores proximais γ-globina, quanto através de interações de longo alcance com uma variedade de regiões através do cluster genético β-globina (Xu et al. 2010). Quando o BCL11A está ausente, a conformação do locus β-globin muda de tal forma que o realçador a montante conhecido como a região de controle do locus é justaposto com os genes de γ-globin ativados por transcrição. Um fenómeno semelhante ocorre quando as células são tratadas com inibidores HDAC que induzem a expressão do gene γ-globina (Bradner et al. 2010). Entretanto, não está claro se essas alterações conformacionais são mediadas diretamente pelo BCL11A ou se essas alterações ocorrem secundariamente ao efeito indutor de HbF da inibição do BCL11A (ou HDAC). No entanto, estes resultados apoiam fortemente a noção de que o BCL11A parece ter um papel directo no silenciamento da expressão γ-globina dentro do locus β-globin. Ao mapear uma variedade de deleções dentro do locus humano β-globina que resultam em δβ-talassemia, com modestos aumentos na HbF e algum desequilíbrio remanescente na cadeia da globina presente, ou HPFH, com aumentos robustos na HbF e síntese equilibrada da cadeia da globina, foi mostrado que uma região N3-kb a montante do gene δ-globina é necessária para o silenciamento dos genes γ-globina (Fig. 2) (Sankaran et al. 2011c). Curiosamente, esta região abriga sites de ligação para o BCL11A, juntamente com seus parceiros como o GATA1 e o HDAC1. É de notar que esta região também tem sido implicada de forma independente como sendo importante para o silenciamento de γ-globina através de estudos da supressão da talassemia de Corfu em humanos (Chakalova et al. 2005). Este estudo fornece uma importante visão mecanicista sobre como o BCL11A funciona para silenciar HbF e reforça a importância das mutações humanas naturais na compreensão deste processo de desenvolvimento que é exclusivo dos seres humanos (Fig. 2) (Sankaran et al. 2011c).

Dados estes achados, BCL11A é provável que seja um alvo terapêutico importante. O fato de sua inativação induzir a HbF sem resultar em uma grande perturbação na eritropoiese é muito promissor, embora seja conhecido por ter efeitos importantes em outras linhagens como os linfócitos B, enfatizando a importância da modelagem e análise in vivo como parte dos esforços contínuos para atingir BCL11A para indução de HbF. Outros estudos explorando os mecanismos de ação pelos quais as funções do BCL11A poderiam levar a abordagens melhores e mais especificamente orientadas para a indução de HbF (Sankaran et al. 2011c). SOX6 também pode ser um alvo potencialmente promissor para a indução de HbF (Xu et al. 2010), embora sabidamente seja necessário para a eritropoiese normal (Dumitriu et al. 2006). Entretanto, um paciente tem sido relatado com uma interrupção heterozigótica da SOX6 que não teve níveis elevados de HbF, sugerindo que o gene SOX6 pode ter um mecanismo de compensação da dosagem ou que pode haver um limiar particular necessário para reduzir a expressão deste gene para ter indução robusta de HbF (Sankaran et al. 2011a). Isto sugere que pode haver limitações em considerar o SOX6 como um alvo potencial de indução de HbF.

Segundo os estudos iniciais sobre BCL11A, dois estudos sugerem que a expressão do BCL11A parece ser controlada pelo fator de transcrição específico do eritróide KLF1 usando abordagens independentes e complementares. Em um estudo, um rato com um alelo hipomórfico de KLF1 resultou em elevações da expressão da globina embrionária e ratos transgénicos com o humano β-globin locus mostrou expressão persistente de γ-globin (Zhou et al. 2010). Como resultado, os investigadores testaram se a mesma regulação poderia ocorrer em células eritróides humanas primárias e poderiam mostrar uma conexão similar usando abordagens de shRNA. Os investigadores mostraram então que este efeito ocorre através dos dois efeitos directos da KLF1 no locus β-globin locus, mas também através de efeitos indirectos mediados pela expressão reduzida da BCL11A no KLF1 knockdown. Esta descoberta mostrou que o KLF1 foi um regulador transcripcional positivo directo da expressão do BCL11A. Um segundo grupo examinou a base genética de uma forma desvinculada de HPFH que foi sugerida como resultado de uma mutação de falta de sentido KLF1 nesta família (Borg et al. 2010). Os investigadores puderam mostrar, usando células primárias destes pacientes e de controles não afetados, que o efeito visto foi em parte atribuível a um efeito silencioso de KLF1 no BCL11A. Uma área de incerteza contínua relaciona-se com os fenótipos humanos vistos com vários casos de mutações de KLF1. Embora no relatório inicial, todos os receptores da mutação de missense tivessem elevações na expressão de HbF, deve ser notado que isto realmente variou entre 3% e 19% dos níveis totais de hemoglobina. Além disso, outros relatos de mutações heterozigotas de KLF1 em humanos ou mostram interrupção concomitante da eritropoiese ou mostram pouco efeito na expressão da HbF (Arnaud et al. 2010; Satta et al. 2011). Estudos mais recentes sugerem que variantes raras em KLF1 estão de fato associadas a elevações em HbF, mas isso não parece ocorrer de forma consistente ou na mesma medida mesmo com mutações similares (Gallienne et al. 2012). A base desta variação permanece por determinar e será importante para compreender melhor os mecanismos pelos quais a KLF1 age direta e indiretamente, para afetar a expressão da HbF. Isto será crítico para qualquer trabalho futuro que tente visar KLF1 para indução de HbF, particularmente se os efeitos desfavoráveis de tal inibição na diferenciação eritróide devem ser evitados. Entretanto, dada a especificidade da KLF1 dentro da linhagem eritróide e se a atividade reguladora do gene globina da KLF1 puder ser especificamente direcionada, ela ainda deve ser considerada como candidata à indução de HbF.

Além das variantes genéticas comuns identificadas no BCL11A associadas aos níveis de HbF em humanos, os estudos GWAS mostraram que existiam variantes no cromossomo 6 intergênico entre os genes HBS1L e MYB que parecem ter um efeito dramático nos níveis de HbF em humanos (Menzel et al. 2007; Thein et al. 2007; Lettre et al. 2008; Uda et al. 2008). É importante compreender o mecanismo de ação pelo qual essas variantes resultam em alterações nos níveis de HbF, pois as variantes genéticas nesse locus parecem ter um efeito tão grande ou talvez até maior na morbidade clínica no locus β-hemoglobinopatias como aquelas variantes no locus BCL11A (Galanello et al. 2009; Nuinoon et al. 2010). Curiosamente, esta região contém uma variedade de elementos reguladores que têm sido sugeridos para ter um papel importante na regulação da expressão da MYB em progenitores eritróides (Mukai et al. 2006; Wahlberg et al. 2009; Stadhouders et al. 2011). Embora a superexpressão da HBS1L não parecesse afetar a expressão da γ-globina nas células de eritroleucemia K562, a superexpressão da MYB pareceu afetar o nível de γ-globina produzida nessas células (Jiang et al. 2006). Além disso, as culturas de progenitores eritróides primários de humanos com maior expressão de HbF tinham mais frequentemente diminuição da expressão da MYB (Jiang et al. 2006).

Ao seguir a observação clínica clássica de que os pacientes com uma trissomia do cromossoma 13 têm uma troca de hemoglobina fetal para adulto atrasada e continuam a ter expressão persistente de HbF (Huehns et al. 1964; Sankaran e Sapp 2012), estudos recentes forneceram mais evidências de um papel da MYB na regulação da expressão da HbF. Através do mapeamento fino e da realização de análise genómica integradora de genes numa região do cromossoma 13 implicada como sendo necessária para a elevação da HbF observada em doentes com trissomias parciais do cromossoma 13, verificou-se que existiam duas pequenas moléculas de RNA nucleotídicas ∼22 que eram os principais candidatos para realizar tal actividade, microRNAs 15a e 16-1 (Sankaran et al. 2011b). A superexpressão desses microRNAs em células eritróides adultas primárias em cultura resultou em aumentos na produção de γ-globina. Ao examinar os alvos desses microRNAs, notou-se que um dos principais alvos em células eritróides era o MYB. A eliminação directa da MYB em progenitores eritróides adultos primários resultou em aumentos dramáticos na produção de globina em γ (Sankaran et al. 2011b), ligando esta observação histórica de uma rara síndrome de aneuploidia humana ao trabalho mais recente de análise dos mecanismos moleculares que regulam os níveis de HbF.

O mecanismo pelo qual a MYB pode agir para regular os níveis de HbF permanece pouco claro. Isto pode ser devido a um efeito sobre a cinética da eritropoiese ou, alternativamente, também pode ocorrer como resultado de um efeito directo dentro do locus β-globin locus (Higgs and Wood 2008). Será necessário um trabalho adicional para explorar tais mecanismos e manter grandes promessas nas tentativas de atingir terapeuticamente esta molécula para indução de HbF. Existe a preocupação de que a focalização da MYB possa ter efeitos secundários indesejáveis, particularmente dado o papel pleiotrópico da MYB na hematopoiese (Emambokus et al. 2003; Carpinelli et al. 2004). No entanto, trabalhos recentes sugerem que tais estratégias podem realmente ser promissoras, porque a derrubada parcial da Myb em ratos teve pouco efeito na hematopoiese in vivo normal, enquanto bloqueou dramaticamente a progressão das leucemias (Zuber et al. 2011a). Portanto, a inibição parcial da MYB pode se manter prometedora como uma estratégia valiosa para a indução de HbF. A aditividade dos efeitos das variantes na região intergênica HBS1L-MYB juntamente com as variantes no locus BCL11A (Lettre et al. 2008; Galanello et al. 2009; Nuinoon et al. 2010) sugere que a segmentação desses dois caminhos em conjunto poderia produzir efeitos ainda mais robustos do que a segmentação de qualquer um dos caminhos sozinho.

Embora os reguladores da regulação da HbF discutidos acima tenham sido encontrados através de estudos genéticos humanos, confirmando assim sua relevância in vivo em humanos, uma variedade de outras moléculas também tem sido sugerida para desempenhar papéis em γ-globina regulação gênica através de vários estudos usando abordagens de cultura celular ou com modelos de camundongos (Tabela 1). Estas moléculas serão discutidas abaixo. É importante ter em mente que existem limitações para a maioria dos sistemas experimentais atualmente disponíveis usados para estudar a regulação gênica da γ-globina. As células eritróides humanas primárias parecem ser permissivas à manipulação que permitirá aumentos na produção de γ-globina, que pode nem sempre ser relevante em humanos in vivo. Além disso, muitos dos estímulos conhecidos para induzir a produção de γ-globina in vivo em humanos, incluindo vários tipos de eritropoiese de estresse e tratamento com hidroxiureia, não funcionam para induzir a produção de γ-globina em modelos humanizados de camundongos (Pace et al. 1994; Sankaran et al. 2009) enfatizando uma importante limitação para a interpretação de achados negativos neste sistema experimental. Assim, deve-se ter cautela ao interpretar achados experimentais não suportados por evidências de estudos genéticos humanos ou estudos realizados em humanos ou primatas in vivo.

Examinando proteínas que ligam os elementos de repetição directa encontrados dentro do promotor dos genes γ-globina, os receptores de hormônio nuclear TR2 e TR4 foram sugeridos para desempenhar um papel de repressores da expressão dos genes γ-globina (Tanabe et al. 2002, 2007; Cui et al. 2011). Paradoxalmente, a superexpressão dos TR2 e TR4 em modelos de camundongos transgénicos resulta numa expressão elevada de γ-globina e quando superexpressos em modelos de camundongos com doença falciforme pode resultar numa melhoria parcial dos sintomas hematológicos e patológicos destes ratos (Campbell et al. 2011). Os mecanismos subjacentes a estas observações e a relevância para a regulação do gene da globina humana ainda não foram estabelecidos para TR2 e TR4. Além disso, o receptor nuclear órfão do hormônio nuclear COUP-TFII também foi sugerido para se ligar às repetições diretas e reprimir o promotor γ-globina em humanos (Filipe et al. 1999). Utilizando culturas in vitro de células eritróides adultas primárias, foi demonstrado que citocinas como a SCF parecem diminuir a expressão e a ocupação de cromatina da COUP-TFII no locus β-globin locus, resultando no aumento da expressão da γ-globina (Aerbajinai et al. 2009). Além disso, a regulação direta para baixo da COUP-TFII utilizando pequenos RNAs interferentes (siRNAs) poderia resultar em aumentos na produção de γ-globina (Aerbajinai et al. 2009). Outros estudos sobre o papel dos COUP-TFs na regulação da HbF serão necessários para compreender melhor o seu papel fisiológico em humanos.

Estudos recentes também sugeriram um papel para o gene chamado amigo da PRMT1 (FOP1) na repressão da expressão do gene γ-globina (van Dijk et al. 2010). A destruição do FOP1 resulta em uma expressão elevada de HbF em células eritróides adultas humanas em cultura. Foi sugerido que isso foi mediado pela redução da expressão do SOX6, cuja derrubada também é conhecida por resultar em aumentos na produção de γ-globina (Xu et al. 2010). Mais trabalho será necessário para confirmar estes achados, entender se este gene também tem um papel mais amplo na eritropoiese e examinar o mecanismo subjacente a estas observações.

Alguns estudos também sugeriram um papel para a proteína proteína NF-E4 seletora de estágio como ativadora da expressão da globina em humanos (Jane et al. 1995; Zhao et al. 2006). Tem sido sugerido que uma forma curta de NF-E4 pode ter um papel na repressão dos genes γ-globina, inibindo a função ativadora normal da NF-E4 no promotor desses genes (Zhou et al. 2004). Todos estes estudos têm sido baseados em experimentos realizados em células cultivadas e purificação bioquímica de complexos proteicos de células K562 e, portanto, será necessário mais trabalho para confirmar o papel fisiológico deste gene na expressão da γ-globina e compreender melhor os mecanismos pelos quais este complexo pode estar agindo para alterar a regulação gênica da globina humana.