Colocalizarea cu o singură moleculă de înaltă rezoluție a Cy3 și Cy5 atașate la macromolecule măsoară distanțele intramoleculare în timp

Materiale și metode

Prepararea ADN-ului duplex. Pentru a realiza moleculele de ADN duplex de 30-bp, s-au hibridizat două oligonucleotide cu următoarea secvență și modificări (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Oligonucleotidul 5′-GGGTATGGAGAGATTTTTTTAGCGGAGTGACAGC-3′ a fost marcat cu Cy5 la capătul 5′ și cu Cy3 la capătul 3′. Oligonucleotidul complementar a fost marcat cu biotină la ambele capete.

Expresia și purificarea proteinei. Gena proteinei fluorescente galbene (YFP) din plasmidul p2Bac/pFastBac-YFP-M5-CaM (un cadou de la H. Lee Sweeney, University of Pennsylvania, Philadelphia) a fost eliminată prin PCR. Plasmidul rezultat p2Bac/pFastBac-M5-CaM codifică miozina V de pui care este trunchiată la Glu-1099. Un fermoar de leucină a urmat spirala spiralată nativă pentru a asigura dimerizarea. Pentru a facilita purificarea, proteina miozină V a fost marcată N-terminal cu o etichetă FLAG-tag (DYKDDDDDDK). Două baculovirusuri recombinate au fost generate pentru exprimarea proteinei în celule Sf9. Unul a codificat miozina V trunchiată și calmodulina Drosophila melanogaster derivată din plasmidul p2Bac/pFastBac-M5-CaM. Cel de-al doilea virus a codificat lanțul ușor esențial uman derivat din plasmidul p2Bac/pFastBac-ELC. Ambele virusuri au fost utilizate pentru coinfectarea celulelor Sf9. Proteina a fost exprimată și purificată conform descrierii lui Sweeney et al. (20).

Marcarea și schimbul de calmodulină. Calmodulina a fost exprimată și marcată cu Cy3 sau Cy5 după cum urmează: O singură cisteină a fost introdusă în calmodulina de arici de mare prin intermediul mutației Q143C. Această calmodulină a fost exprimată în Escherichia coli și purificată conform descrierii din ref. 21. Calmodulina a fost marcată fie cu soluții stoc de Cy3-maleimidă, fie cu Cy5-maleimidă (Amersham Biosciences) (în DMSO) într-un raport molar de 1,4 ori timp de 20 de minute. Excesul de colorant a fost eliminat prin filtrare pe gel în tampon de schimb (mai jos), urmată de absorbția hidrofobă peste noapte pe BioBeads (Bio-Rad). Încorporarea etichetei a fost de 102% pentru Cy3-calmodulină și de 75% pentru Cy5-calmodulină. Alianțele au fost păstrate la -80°C.

Schimbul de calmodulină marcată pe miozina V a fost efectuat așa cum a fost descris, dar cu unele modificări (22). Miozina V (150 nM) a fost incubată cu 0,7 nM calmodulină marcată Cy3 și 0,8 nM calmodulină marcată Cy5 în tampon de schimb (25 mM KCl/20 mM imidazol HCl, pH 7,4/2 mM MgCl2/1 mM EGTA) la 22°C timp de 2 min. Pentru a schimba calmodulinele, s-a adăugat 0,9 mM CaCl2 și amestecul a fost incubat la 22°C timp de 5 min. Reacția a fost stinsă cu 7 mM EGTA. Amestecul de reacție a fost aplicat pe un dispozitiv de ultrafiltrare Nanocep de 100K MWCO (Pall) și a fost spălat de trei ori cu volume egale de AB (mai jos) pentru a purifica miozina V din excesul de calmodulină.

Pregătirea celulei de flux. Celula de curgere a fost construită cu o lamelă de microscop din sticlă și cu lamele de acoperire cu refracție mare realizate din NLAF21 (VA Optical Labs, San Anselmo, CA) ținute împreună de bucăți de bandă Scotch cu două fețe.

Pentru experimentele cu miozina V, 15 μl de biotină-BSA (1 mg-ml-1) au fost incubate în celula de curgere timp de 2 minute, după care 30 μl de tampon AB (25 mM KCl/25 mM imidazol HCl, pH 7,4/1 mM EGTA/4 mM MgCl2/10 mM DTT/1 mg-ml-1 BSA) au fost trecute prin celula de curgere pentru a fi spălate. Cincisprezece microlitri de NeutrAvidin 0,5 mg/ml (Molecular Probes) au fost adăugați în celulă și au fost lăsați să se incubeze timp de 2 minute, după care s-a efectuat o altă spălare cu tampon AB. Celula de curgere a fost incubată cu 15 μl de filamente de actină faloidină biotinilată (250 nM) timp de 5 min, după care s-a efectuat o spălare de 100 μl cu tampon AB. În cele din urmă, celula a fost încărcată cu 20 μl de tampon de formare a imaginii, inclusiv miozina V schimbată cu calmodulină, 5 μM calmodulină, 300 nM ATP, un sistem de regenerare a ATP (0,1 mg-ml-1 creatinfosfokinază/1 mM creatinfosfat) și 0,5% (vol/vol) Triton-X 100 pentru a reduce legarea nespecifică. Celula a fost sigilată cu unsoare în vid și s-a realizat imediat imagistica. Concentrația finală a motorului a avut ca rezultat o actină slab decorată și, astfel, a permis o analiză a moleculelor de miozină V individuale.

Pentru experimentele cu ADN, biotina-BSA și NeutrAvidina au fost încărcate în același mod ca pentru experimentele cu miozină V, dar spălările s-au făcut cu tamponul T50 (10 mM Tris, pH 8,0/50 mM NaCl). După ce celula de curgere a fost acoperită cu NeutrAvidin, s-au introdus 15 μlof de dsADN (30 nM) în tamponul T50 cu 1 mg-ml-1 BSA și s-au incubat timp de 2 minute, după care s-au introdus 100 μl de tampon de imagistică. Celula de curgere a fost apoi sigilată cu unsoare de vid și a fost imediat imagistică. Decorarea rezultată a moleculelor de ADN pe suprafață a fost suficient de rară pentru ca petele fluorescente de la molecule diferite să se suprapună rareori.

Configurație microscopică. Microscopul de fluorescență cu reflexie internă totală (TIRF) a fost configurat așa cum este descris în ref. 8, cu unele modificări (Fig. 5, care este publicată ca informație suport pe site-ul web PNAS). Fasciculele de surse de excitație la 532 nm (Coherent, Santa Clara, CA) și 633 nm (JDS Uniphase, San Jose, CA) au fost combinate de o oglindă dicroică și extinse la un diametru de 7 mm. Aceste surse au fost focalizate (distanța focală = 500 mm) pe planul focal posterior al unui obiectiv TIRF Olympus 1,65 NA ×100 cu ajutorul unei linii laser dicroice pe o translație liniară DeepL care permite funcționarea microscopului în modurile epifluorescență sau TIRF. Obiectivul a fost poziționat sub o translație piezoelectrică nanoDeepL în buclă închisă, cu două axe, echipată cu senzori capacitivi pentru măsurarea poziției (Physik Instrumente, Auburn, MA). Lumina reflectată care iese prin deschiderea din spate a obiectivului a fost dirijată pe o fotodiodă de cadran pentru a furniza un semnal pentru o buclă de feedback de focalizare care a fixat distanța dintre obiectiv și probă cu un actuator electrostrictiv (Newport, Fountain Valley, CA). Emisia de fluorescență a fost colectată de obiectiv, a trecut prin două filtre StopLine cu peliculă subțire (Semrock, Rochester, NY), unul pentru fiecare sursă de excitație, și a fost transmisă printr-un aparat cu vedere dublă care a permis formarea simultană de imagini ale canalelor Cy3 și Cy5 pe o singură cameră EMCCD iXon DV 887 (Andor Technology, Belfast, Irlanda). Toate datele au fost imaginate cu un timp de integrare de 0,5 secunde. Se presupune că diafonia dintre cele două canale (10 %) influențează măsurătorile distanței spre valori mai mici. Cu toate acestea, eroarea noastră experimentală o face nedetectabilă, după cum arată simulările Monte Carlo în care 100 de perechi de imagini modelate ale unor fluorofori unici separați de 10 nm au fost create și analizate în mod identic ca și în cazul datelor ADN (descrise mai jos). Imaginile simulate ale funcțiilor de răspândire a punctelor de fluorescență au fost calculate prin generarea unei distribuții de intensitate gaussiene 2D integrate cu un fond constant la care s-a adăugat zgomotul de împușcare. Vârfurile simulate au avut aceleași dimensiuni și același raport semnal/zgomot ca și vârfurile reale. Datele simulate cu o diafonie de 10% și datele simulate fără diafonie sunt imposibil de distins printr-un test Kolmogorov-Smirnov (N 1 = 100, N 2 = 100, p > 0,05).

Analiza datelor. S-a realizat o cartografiere de înregistrare a canalelor Cy3 și Cy5 cu ajutorul unor elemente de referință constând în bile TransFluoSphere de 100 nm (Molecular Probes). Acestea au fost excitate la 532 nm și emit cu un spectru de emisie larg. Bila a fost detectabilă în ambele noastre canale. Am localizat o singură perlă asociată la lamelă de acoperire și, cu ajutorul treptei noastre piezoelectrice, am făcut un pas cu precizie nanometrică într-un model de grilă (cu o spațiere de 0,5 μm), luând o imagine la fiecare oprire. Rezultatul final a fost o stivă de 312 imagini care arată perla în ambele canale în diferite poziții (Fig. 1a ).