PMC

Promisiunea unor terapii îmbunătățite prin studii moleculare ale reglării hemoglobinei fetale

Deși abordările terapeutice fără scop precis discutate mai sus s-au dovedit a fi promițătoare și au avut un oarecare succes în ceea ce privește inducerea HbF în mediul clinic, o mai bună înțelegere mecanică a fundamentelor moleculare necesare pentru trecerea normală de la hemoglobina fetală la cea adultă reprezintă o mare promisiune pentru a permite dezvoltarea unor abordări mai eficiente și mai specific direcționate pentru inducerea HbF. În deceniile care au urmat clonării moleculare a genelor globinei, au fost identificați o varietate de factori de transcripție care au jucat roluri în reglarea genei globinei (Cantor și Orkin 2002). Printre aceștia s-au numărat factori de transcripție precum GATA1, KLF1 și SCL/ TAL1. Cu toate acestea, studierea rolului acestor factori în reglarea genei globinei a fost încurcată de rolul larg al acestor factori în diferențiere și de rolurile lor pleiotropice ca regulatori ai globinei și ai reglării genelor eritroide. Niciunul dintre acești factori nu a părut să fie regulatori specifici ai trecerii de la hemoglobină fetală la hemoglobină adultă. A fost nevoie de aproape trei decenii de la clonarea inițială a genelor globinei înainte de a fi identificați regulatorii specifici ai acestui proces.

Indicii importante în ceea ce privește identitatea acestor factori au apărut din studiul variației genetice umane naturale. O serie de grupuri au urmărit bazele variației genetice comune a nivelurilor de HbF folosind atât studii de asociere țintite, cât și studii de asociere la nivelul întregului genom (GWAS) (Menzel et al. 2007; Thein et al. 2007; Lettre et al. 2008; Uda et al. 2008). Aceste studii au dus la identificarea a trei loci genomici care adăpostesc variante comune care influențează nivelurile de HbF. Printre acestea se numără o regiune a cromozomului 2 în cadrul genei BCL11A, o regiune intergenică între genele HBS1L și MYB de pe cromozomul 6 și variantele din cadrul locusului β-globinei de pe cromozomul 11. Studii recente care au cartografiat mai fin aceste variante genetice sugerează că >50 % din variația nivelurilor de HbF poate fi explicată prin variația comună la acești trei loci (Galarneau et al. 2010). Deși se consideră că nivelurile de HbF au o componentă genetică ereditară în intervalul de ∼80%, este important de reținut faptul că variația genetică aditivă constatată din variantele genetice comune ignoră eventualele interacțiuni genetice de ordin superior care ar putea să nu fie detectate și, prin urmare, măsura în care nivelurile de HbF sunt determinate genetic rămâne să fie explorată în studii viitoare (Zuk et al. 2012).

Observarea inițială a variantelor asociate cu nivelurile HbF în cadrul factorului de transcripție cu degete de zinc BCL11A a condus la un studiu inițial care a urmărit ipoteza că BCL11A poate fi un regulator al expresiei HbF (Sankaran et al. 2008). Lucrările anterioare au sugerat că BCL11A era un regulator transcripțional critic implicat în limfopoieza B și neurogeneza (Sankaran et al. 2010). Nivelurile proteinei BCL11A păreau să fie corelate cu stadiul de dezvoltare a expresiei, astfel încât celulele eritroide definitive ale ficatului primitiv și fetal, care exprimau niveluri ridicate de γ-globină, aveau o expresie scăzută sau absentă a formelor de lungime completă a BCL11A. Acest rezultat a sugerat că acest produs genic acționează ca un represor al genelor γ-globinei. Pentru a testa în mod direct acest lucru, s-a efectuat o reducere a BCL11A folosind abordări cu ARN cu fir scurt de păr (shRNA) în progenitori eritroizi adulți primari, iar expresia γ-globinei a putut fi indusă în mod robust în urma unei astfel de reduceri. Gradul de inducție a γ-globinei a părut să fie legat de gradul de eliminare a BCL11A. În mod interesant, perturbările majore ale eritropoiezei nu au părut să apară în ciuda inducerii robuste a γ-globinei observate. Studiile ulterioare au arătat rezultate similare atunci când a fost eliminată expresia BCL11A cu ajutorul ARNm (Borg et al. 2010; Zhou et al. 2010; Wilber et al. 2011). S-a demonstrat, de asemenea, că BCL11A interacționează direct cu cromatina la nivelul locusului β-globinei umane în celulele eritroide primare și că pare să acționeze ca parte a unui complex cu factorul de transcripție GATA1 și cu complexul de remodelare și reprimare a cromatinei NuRD (Sankaran et al. 2008). Este interesant faptul că complexul NuRD conține HDAC-urile 1 și 2, care au fost sugerate ca fiind HDAC-urile critice necesare pentru reducerea la tăcere a HbF (Bradner et al. 2010). În plus, s-a sugerat că factorul de transcripție SOX6 poate coopera cu BCL11A pentru a contribui la reducerea la tăcere a genelor γ-globinei la om și poate fi esențial pentru legarea promotorului proximal al acestor gene de globină (Xu et al. 2010).

Deși comutarea hemoglobinei la modelele de șoareci, chiar și la cele care adăpostesc o transgenă a locusului β-globinei umane, pare să difere de ontogeneza normală a expresiei globinei observată la om, s-a demonstrat la șoareci un rol conservat din punct de vedere evolutiv al BCL11A în silențierea și comutarea genelor globinei (Sankaran et al. 2009; McGrath et al. 2011). Șoarecii lipsiți de BCL11A par să aibă o eritropoieză normală, dar nu reușesc să reducă complet la tăcere genele globinei embrionare în celulele eritroide definitive și permit o anumită expresie persistentă a γ-globinei atunci când este prezent locusul intact al β-globinei umane. Aceste constatări întăresc importanța lui BCL11A ca mediator critic al comutării globinei la mamifere. Deși acest studiu inițial a abordat rolul BCL11A în procesul de dezvoltare a schimbării globinei la șoareci (Sankaran et al. 2009), un studiu mai recent a utilizat inactivarea condiționată a BCL11A pentru a arăta că inactivarea inductibilă poate avea ca rezultat o inducție robustă și similară a inducției genei γ-globinei, așa cum se întâmplă atunci când inactivarea are loc la momente mai timpurii (Xu et al. 2011). Mai mult, deși există o reglare diferențiată a genelor globinei între oameni și șoareci, s-a demonstrat că inactivarea BCL11A este suficientă pentru a ameliora caracteristicile hematologice și patologice observate în modelele de șoareci de anemie falciformă, ceea ce oferă o dovadă importantă a eficacității potențiale a direcționării BCL11A pentru a induce HbF (Xu et al. 2011).

Mecanismele exacte prin care BCL11A reduce la tăcere expresia genei γ-globinei rămân neclare. Un studiu recent sugerează că acest lucru poate fi mediat atât prin interacțiuni cu factori de transcripție, cum ar fi SOX6, care se leagă de cromatină la promotorii proximali ai γ-globinei, cât și prin interacțiuni pe distanțe lungi cu o varietate de regiuni din tot clusterul genelor β-globinei (Xu et al. 2010). Atunci când BCL11A este absent, conformația locusului β-globinei se modifică astfel încât potențiatorul din amonte, cunoscut sub numele de regiunea de control a locusului, este juxtapus cu genele γ-globinei activate transcripțional. Un fenomen similar are loc atunci când celulele sunt tratate cu inhibitori HDAC care induc expresia genelor γ-globinei (Bradner et al. 2010). Cu toate acestea, nu este clar dacă aceste modificări conformaționale sunt mediate în mod direct de BCL11A sau dacă aceste modificări apar în mod secundar la efectul de inducere a HbF al inhibării BCL11A (sau HDAC). Cu toate acestea, aceste constatări susțin puternic ideea că BCL11A pare să aibă un rol direct în reducerea la tăcere a expresiei γ-globinei în cadrul locusului β-globinei. Prin cartografierea unei varietăți de deleții în cadrul locusului β-globinei umane care au ca rezultat fie o δβ-talasemie, cu creșteri modeste ale HbF și un dezechilibru al lanțului globinic rămas prezent, fie HPFH, cu creșteri puternice ale HbF și o sinteză echilibrată a lanțului globinic, s-a demonstrat că o regiune N3-kb în amonte de gena δ-globinei este necesară pentru reducerea la tăcere a genelor γ-globinei (Fig. 2) (Sankaran și colab. 2011c). În mod interesant, această regiune adăpostește situsuri de legare pentru BCL11A, împreună cu partenerii săi, cum ar fi GATA1 și HDAC1. De remarcat, această regiune a fost, de asemenea, implicată în mod independent ca fiind importantă pentru reducerea la tăcere a γ-globinei prin studii privind deleția talasemiei Corfu la om (Chakalova et al. 2005). Acest studiu oferă o perspectivă mecanicistă importantă despre modul în care BCL11A funcționează pentru a reduce la tăcere HbF și întărește importanța mutațiilor umane naturale în înțelegerea acestui proces de dezvoltare care este unic la oameni (Fig. 2) (Sankaran et al. 2011c).

Datorită acestor constatări, este probabil ca BCL11A să fie o țintă terapeutică importantă. Faptul că inactivarea sa induce HbF fără a avea ca rezultat o perturbare majoră a eritropoiezei este foarte promițător, deși se știe că are efecte importante în alte neamuri, cum ar fi limfocitele B, subliniind importanța modelării și analizei in vivo ca parte a eforturilor în curs de a ținti BCL11A pentru inducerea HbF. Studiile suplimentare care explorează mecanismele de acțiune prin care funcționează BCL11A ar putea conduce la abordări mai bune și mai specific direcționate pentru inducerea HbF (Sankaran et al. 2011c). SOX6 poate fi, de asemenea, o țintă potențial promițătoare pentru inducerea HbF (Xu et al. 2010), deși se știe că este necesară pentru eritropoieza normală (Dumitriu et al. 2006). Cu toate acestea, a fost raportat un pacient cu o întrerupere heterozigotă a SOX6 care nu a prezentat niveluri ridicate de HbF, ceea ce sugerează că gena SOX6 ar putea avea un mecanism de compensare a dozei sau că ar putea exista un anumit prag necesar pentru reducerea expresiei acestei gene pentru a avea o inducție robustă a HbF (Sankaran et al. 2011a). Acest lucru sugerează că pot exista limitări în considerarea SOX6 ca o potențială țintă de inducție a HbF.

În urma studiilor inițiale privind BCL11A, două studii au sugerat că expresia BCL11A pare să fie controlată de factorul de transcripție specific eritroidelor KLF1, utilizând abordări independente și complementare. Într-un studiu, un șoarece cu o alelă hipomorfă a KLF1 a dus la creșteri ale expresiei globinei embrionare, iar șoarecii transgenici cu locusul β-globinei umane au prezentat o expresie persistentă a γ-globinei (Zhou et al. 2010). Ca urmare, cercetătorii au testat dacă aceeași reglare ar putea avea loc în celulele eritroide umane primare și ar putea arăta o legătură similară folosind abordări shRNA. Cercetătorii au arătat apoi că acest efect se produce atât prin efecte directe ale KLF1 la nivelul locusului β-globinei, dar și prin efecte indirecte mediate prin expresia redusă a BCL11A în cazul eliminării KLF1. Această constatare a arătat că KLF1 a fost un regulator transcripțional pozitiv direct al expresiei BCL11A. Un al doilea grup a examinat baza genetică a unei forme nelegate de HPFH care a fost sugerată ca fiind rezultatul unei mutații de tip missense a KLF1 în această familie (Borg et al. 2010). Cercetătorii au putut demonstra, folosind celule primare de la acești pacienți și de la martori neafectați, că efectul observat a fost parțial atribuit unui efect de reducere la tăcere a KLF1 asupra BCL11A. O zonă de incertitudine continuă se referă la fenotipurile umane observate în diverse cazuri de mutații KLF1. Deși în raportul inițial, toți beneficiarii mutației cu sens greșit prezentau creșteri ale expresiei HbF, trebuie remarcat faptul că aceasta a variat de fapt între 3% și 19% din nivelul total al hemoglobinei. În plus, alte rapoarte de mutații heterozigote KLF1 la om fie arată o întrerupere concomitentă a eritropoiezei, fie arată un efect redus asupra expresiei HbF (Arnaud et al. 2010; Satta et al. 2011). Studii mai recente sugerează că variantele rare în KLF1 sunt într-adevăr asociate cu creșteri ale HbF, dar acest lucru nu pare să se întâmple în mod constant sau în aceeași măsură chiar și cu mutații similare (Gallienne et al. 2012). Baza acestei variații rămâne să fie determinată și va fi importantă pentru a înțelege mai bine mecanismele prin care KLF1 acționează atât direct, cât și indirect, pentru a afecta expresia HbF. Acest lucru va fi esențial pentru orice lucrare viitoare care va încerca să vizeze KLF1 pentru inducerea HbF, în special dacă vor fi evitate efectele neplăcute ale unei astfel de inhibiții asupra diferențierii eritroide. Cu toate acestea, având în vedere specificitatea KLF1 în cadrul liniei eritroide și în cazul în care activitatea de reglare a genei globinei a KLF1 ar putea fi țintită în mod specific, aceasta ar trebui să fie considerată în continuare un candidat pentru inducerea HbF.

În plus față de variantele genetice comune identificate în BCL11A asociate cu nivelurile HbF la om, studiile GWAS au arătat că există variante pe cromozomul 6 intergenic între genele HBS1L și MYB care par să aibă un efect dramatic asupra nivelurilor HbF la om (Menzel et al. 2007; Thein et al. 2007; Lettre et al. 2008; Uda et al. 2008). Este important să se înțeleagă mecanismul de acțiune prin care aceste variante determină modificări ale nivelurilor de HbF, deoarece variantele genetice de la acest locus par să aibă un efect la fel de mare sau poate chiar mai mare asupra morbidității clinice în cazul β-hemoglobinopatiilor decât variantele de la locusul BCL11A (Galanello et al. 2009; Nuinoon et al. 2010). Este interesant faptul că această regiune conține o varietate de elemente de reglementare care au fost sugerate ca având un rol important în reglarea expresiei MYB în progenitorii eritroizi (Mukai et al. 2006; Wahlberg et al. 2009; Stadhouders et al. 2011). Deși supraexprimarea HBS1L nu a părut să afecteze expresia γ-globinei în celulele eritroleucemice K562, supraexprimarea MYB a părut să afecteze nivelul de γ-globină produsă în aceste celule (Jiang et al. 2006). Mai mult, culturile de progenitori eritroizi primari de la oameni cu o expresie mai mare a HbF prezentau mai des o expresie scăzută a MYB (Jiang et al. 2006).

Prin continuarea observației clinice clasice conform căreia pacienții cu o trisomie a cromozomului 13 au o schimbare întârziată a hemoglobinei de la fetus la adult și continuă să aibă o expresie persistentă a HbF (Huehns et al. 1964; Sankaran și Sapp 2012), studiile recente au furnizat dovezi suplimentare pentru un rol al MYB în reglarea expresiei HbF. Prin cartografierea fină și efectuarea unei analize genomice integrative a genelor dintr-o regiune de pe cromozomul 13 implicată ca fiind necesară pentru creșterea HbF observată la pacienții cu trisomii parțiale ale cromozomului 13, s-a constatat că existau două molecule mici de ARN cu ∼22 nucleotide care erau candidați de top pentru a desfășura o astfel de activitate, microARN-urile 15a și 16-1 (Sankaran et al. 2011b). Supraexprimarea acestor microARN-uri în celulele eritroide adulte primare în cultură a dus la creșterea producției de γ-globină. Examinând țintele acestor microARN-uri, s-a observat că o țintă majoră în celulele eritroide a fost MYB. Eliminarea directă a MYB în progenitorii eritroizi primari adulți a dus la creșteri dramatice ale producției de γ-globină (Sankaran et al. 2011b), făcând legătura între această observație istorică dintr-un sindrom de aneuploidie umană rară și lucrările mai recente care examinează mecanismele moleculare care reglează nivelurile de HbF.

Mecanismul prin care MYB poate acționa pentru a regla nivelurile de HbF rămâne neclar. Acest lucru se poate datora unui efect asupra cineticii eritropoiezei sau, alternativ, poate apărea și ca urmare a unui efect direct în cadrul locusului β-globinei (Higgs și Wood 2008). Vor fi necesare lucrări suplimentare pentru a explora astfel de mecanisme și sunt foarte promițătoare în încercările de a ținti în mod terapeutic această moleculă pentru inducerea HbF. Există îngrijorarea că direcționarea MYB ar putea avea efecte secundare nedorite, în special având în vedere rolul pleiotropic al MYB în hematopoieză (Emambokus et al. 2003; Carpinelli et al. 2004). Cu toate acestea, lucrări recente sugerează că astfel de strategii pot fi, de fapt, promițătoare, deoarece reducerea parțială a Myb la șoareci a avut un efect redus asupra hematopoiezei normale in vivo, blocând în același timp în mod dramatic progresia leucemiilor (Zuber et al. 2011a). Prin urmare, inhibarea parțială a MYB ar putea fi o strategie valoroasă pentru inducerea HbF. Aditivitatea efectelor variantelor din regiunea intergenică HBS1L-MYB împreună cu variantele de la nivelul locusului BCL11A (Lettre et al. 2008; Galanello et al. 2009; Nuinoon et al. 2010) sugerează că direcționarea acestor două căi împreună ar putea produce efecte chiar mai puternice decât direcționarea unei singure căi.

Deși regulatorii reglării HbF discutați mai sus au fost descoperiți prin studii genetice umane, confirmând astfel relevanța lor in vivo la om, o varietate de alte molecule au fost, de asemenea, sugerate să joace roluri în reglarea genei γ-globinei prin diverse studii care utilizează abordări de culturi celulare sau cu modele de șoareci (tabelul 1). Aceste molecule vor fi discutate mai jos. Este important să se țină cont de faptul că există limitări pentru majoritatea sistemelor experimentale disponibile în prezent utilizate pentru a studia reglarea genei γ-globinei. Celulele eritroide umane primare par să fie permisive la manipulări care vor permite creșterea producției de γ-globină, ceea ce poate să nu fie întotdeauna relevant la oameni in vivo. În plus, mulți dintre stimulii despre care se știe că induc producția de γ-globină in vivo la om, inclusiv diferite tipuri de eritropoieză de stres și tratamentul cu hidroxiuree, nu funcționează pentru a induce producția de γ-globină în modelele de șoareci umanizați (Pace et al. 1994; Sankaran et al. 2009), subliniind o limitare importantă pentru interpretarea rezultatelor negative în acest sistem experimental. Astfel, trebuie să se manifeste prudență atunci când se interpretează constatări experimentale care nu sunt susținute de dovezi din studii genetice umane sau studii efectuate la oameni sau primate in vivo.

Prin examinarea proteinelor care se leagă de elementele de repetiție directă care se găsesc în promotorul genelor γ-globinei, s-a sugerat că receptorii orfani ai hormonilor nucleari TR2 și TR4 joacă un rol de reprimare a expresiei genelor γ-globinei (Tanabe et al. 2002, 2007; Cui et al. 2011). În mod paradoxal, supraexprimarea TR2 și TR4 în modelele de șoareci transgenici are ca rezultat o expresie crescută a γ-globinei și, atunci când este supraexprimată în modele de șoareci cu anemie falciformă, poate duce la ameliorarea parțială a simptomelor hematologice și patologice ale acestor șoareci (Campbell et al. 2011). Mecanismele care stau la baza acestor observații și relevanța pentru reglarea genei globinei umane rămâne de stabilit pentru TR2 și TR4. În plus, s-a sugerat, de asemenea, că receptorul nuclear orfan al hormonului nuclear COUP-TFII se leagă de repetările directe și reprimă promotorul γ-globinei la om (Filipe et al. 1999). Cu ajutorul culturilor in vitro de celule eritroide primare adulte, s-a demonstrat că citokinele, cum ar fi SCF, par să reglementeze în sens negativ expresia și ocuparea cromatinei de către COUP-TFII la nivelul locusului β-globinei, ceea ce duce la creșterea expresiei γ-globinei (Aerbajinai et al. 2009). Mai mult, reducerea directă a COUP-TFII cu ajutorul ARN-urilor mici de interferență (siRNA) ar putea duce la creșterea producției de γ-globină (Aerbajinai et al. 2009). Vor fi necesare studii suplimentare privind rolul COUP-TF în reglarea HbF pentru a înțelege mai bine rolul său fiziologic la om.

Studii recente au sugerat, de asemenea, un rol pentru gena numită friend of PRMT1 (FOP1) în reprimarea expresiei genei γ-globinei (van Dijk et al. 2010). Eliminarea FOP1 are ca rezultat o expresie crescută a HbF în celulele eritroide adulte umane în cultură. S-a sugerat că acest lucru a fost mediat de expresia redusă a SOX6, a cărei reducere este cunoscută ca având ca rezultat, de asemenea, creșterea producției de γ-globină (Xu et al. 2010). Vor fi necesare lucrări suplimentare pentru a confirma aceste constatări, pentru a înțelege dacă această genă are, de asemenea, un rol în eritropoieză în sens mai larg și pentru a examina mecanismul care stă la baza acestor observații.

Câteva studii au sugerat, de asemenea, un rol pentru proteina selectoare de etape NF-E4 ca activator al expresiei γ-globinei la om (Jane et al. 1995; Zhao et al. 2006). S-a sugerat că o formă scurtă a NF-E4 ar putea avea un rol în reprimarea genelor γ-globinei prin inhibarea funcției normale de activare a NF-E4 la nivelul promotorului acestor gene (Zhou et al. 2004). Toate aceste studii s-au bazat pe experimente efectuate pe celule cultivate și pe purificarea biochimică a complexelor proteice din celulele K562 și, prin urmare, vor fi necesare lucrări suplimentare pentru a confirma rolul fiziologic al acestei gene în exprimarea γ-globinei și pentru a înțelege mai bine mecanismele prin care acest complex ar putea acționa pentru a modifica reglarea genei globinei umane.