Transcripția
Transcripția este transferul informației genetice de la ADN la ARN, folosind ADN ca șablon. Sinteza proteinelor are loc în ribozomi.
Ce este o genă? La un anumit nivel, o genă este un șir ordonat de nucleotide care codifică o polipeptidă. Astfel de gene sunt gene „structurale”. De asemenea, știm că genele pot codifica și ARN, inclusiv ARN mesager (ARNm), ARN de transfer (ARNt),ARN ribozomal (ARNr), precum și alte tipuri de ARN. Dar ceva trebuie să pornească și să întrerupă expresia genetică, precum și să o reglementeze. Secvențele de reglare, care pot fi „promotori” sau „amelioratori/silențatori”, pot fi situate la mare distanță de regiunile de codificare. Prin urmare, perspectiva noastră asupra unei gene trebuie să includă ideea de regiuni separate ale unui cromozom. Ce se întâmplă dacă informația transcrisă în ARNm nu reflectă proteina finală până când aceasta nu este modificată ulterior? Aceasta este „modificarea posttranscripțională”. Acum, conceptul de genă devine și mai neclar. Ce se întâmplă dacă există regiuni de codificare „suprapuse”? În mod clar, definiția noastră a unei gene nu va fi una simplă.
Totuși, din punct de vedere funcțional, putem descrie o genă ca având o regiune de codificare distinctă și o regiune de reglare distinctă, aceasta din urmă controlând rata la care ADN-ul este transcris în ARNm. Vom vedea că unitățile de reglare sunt compuse din „motive” de ADN și că fiecare motiv va trebui să fie ocupat de o proteină de reglare pentru ca o genă să fie reglată corespunzător. Nu numai că trebuie să existe un atașament adecvat al proteinei, dar toate proteinele trebuie să se potrivească împreună cu proteinele care se leagă de alte motive din apropiere, așa cum se potrivesc piesele de puzzle. Și nu există decât un singur mod corect pentru ca totul să se potrivească. Așadar, nu este doar o simplă chestiune de ADN care dirijează sinteza ARN-ului, care apoi dirijează sinteza proteinelor; proteinele sunt implicate în mod intrinsec în reglarea producției de proteine la nivelul transcripției.Acest lucru poate deveni un coșmar dacă începi să te gândești la reglarea producției de proteine reglatoare.
De asemenea, trebuie să luăm în considerare o diferență importantă între eucariote și procariote în ceea ce privește transcripția genelor structurale, sau a genelor codificatoare de proteine. La eucariote, genele sunt transcrise individual, în timp ce la procariote, genele cu funcții înrudite („operoni”) pot fi transcrise împreună. De exemplu, operonul Lac include trei gene codificatoare de proteine, precum și secvențele lor de control. Operonul este transcris ca o singură unitate sub forma unui „ARNm policistronic”. Genele structurale eucariote sunt transcrise ca ARNm monocistronic.
Sinteza ARN-ului dirijat de ADN
Există trei etape care caracterizează sinteza ARN-ului dirijat de ADN:
(1) Inițierea prin legarea aparatului de transcripție de șablonul ADN
(2) Alungirea lanțului ARNm
(3) Terminarea lanțului ARNm
Partea de ARNm care rezultă din transcrierea directă a ADN-ului care codifică o „genă” se numește „transcript primar” și suferă modificări, uneori destul de ample, înainte de a-și putea traduce mesajul în proteină.
Clasa de enzime care sintetizează ARN-urile este cunoscută sub numele de ARN polimeraze. Toate sunt complexe cu mai multe subunități prezente în toate celulele și catalizează reacția:
(ARN)nreziduuri + 1 NTP === (ARN)n+1 reziduuri + PPi
Pirofosfatul este hidrolizat ireversibil în 2 Pi, conducând astfel reacția spre dreapta. Nucleotidele individuale care sunt citite de pe șirul șablonului șablon ADN sunt transcrise în nucleotidele ARN-ului corespunzător, astfel încât rezultatul final este un polimer monocatenar, și anume ARNm, ale cărui nucleotide corespund exact nucleotidelor complementare de pe șirul ADN, cu excepția faptului că oriunde apare un „A” în șirul șablon ADN, apare un „U” în ARNm. (NTP-urile posibile, deci, sunt ATP,CTP,GTP,UTP.)
Transcripția la procariote
Cea mai studiată ARN polimerază este cea din E.coli, așa că o vom studia ca prototip al ARN polimerazelor. Holoenzima este o proteină de 449 kDcompusă dintr-o „enzimă nucleu” și o „subunitate s”,iar întregul complex este notat (nucleu)s. Enzima nucleu dirijează reacția de polimerizare și are 4 subunități: enzima nucleu = a2bb’w. Ionii anorganici Zn2+ (doi dintre ei în subunitatea b’) și Mg2+ sunt necesari pentru activitatea catalitică, iar structura tridimensională a enzimei seamănă cu o mână. Degetul mare al mâinii poate fi imaginat ca apucând o bucată de ADN B care se află într-un canal reprezentat de degetele curbate și de palma mâinii. Acest canal este cilindric, cu dimensiuni de ordinul a 25 A pe 55 A. Aceste dimensiuni permit o inserție de aproximativ 16 perechi de baze de ADN B.
Structura „mâinii” apare și la alte enzime pe care le vom studia, inclusiv la ADN polimeraza și transcriptaza inversă. Puteți studia în continuare structura „mână” a ARN-polimerazei prin examinarea ARN-polimerazei T7 (vezi PDB de mai jos).
1ARO: ARN-polimeraza T7
Vom analiza transcripția din punctul de vedere al genei, despre care am menționat deja că este o entitate destul de ambiguă. Cu toate acestea, este clar că trebuie să existe un punct de plecare pentru ca transcrierea corectă să aibă loc și este rezonabil să îl includem ca parte a genei, chiar dacă nu se transcrie el însuși. Așadar, problema inițierii este, de fapt, una de recunoaștere a unui punct de plecare. Dar care dintre cele două șiruri de ADN servește drept șablon și cum alege polimeraza?
Oricare dintre cele două șiruri poate servi drept șablon, dar transcrierea decurge întotdeauna de la capătul 5′ al unui șir de ADN la capătul 3′. Șirul 3′-5′ care servește drept șablon se numește „antisens” sau șir necodificator, iar șirul 5′-3′ (care are aceeași secvență nucleotidică, cu excepția lui „U” în locul lui „T”, ca ARNm transcris ulterior) este șirul „sens” sau „codificator”. Pentru a fi consecvenți și clari, vom folosi convenția conform căreia descrierea poziției de-a lungul unei secvențe de nucleotide se va face din punctul de vedere al șirului de sens, deoarece acesta are aceeași ordine ca și ARNm care este transcris. Partea din genă care servește ca situs de inițiere se numește „promotor” și este căutată de holoenzima ARN polimerazei. Holoenzima se leagă slab de ADN, cu un Kdissoc de aproximativ 10-7 M, ceea ce îi permite să se deplaseze de-a lungul șirului antisens în căutarea promotorului. Subunitatea ss este specifică pentru secvența sa promotoare și are loc o legare strânsă a holoenzimei (Kdissoc de aproximativ 10-14 M).
Promoterul este recunoscut de o secvență nucleotidică de aproximativ 40 pb pe partea 5′ a situsului de inițiere, iar în cadrul acestei secvențe există două secvențe „conservate”. Una dintre acestea are o lungime de 6 pb și este centrată la aproximativ 10 pb în amonte de locul de inițiere a transcripției. Aceasta este „Pribnow Box” și are o secvență consensuală TATAAT.Cealaltă secvență, mai puțin conservată, este centrată la aproximativ 35 bp în amonte și are o secvență consensuală TTGACA.Locul de inițiere este indicat prin notația +1 și este aproape întotdeauna A sau G.
Holoenzima ARN polimerazei intră în contact cu promotorul aproximativ la centrele celor două regiuni (-10 și -35), iar enzima nucleu se leagă strâns de ADN-ul duplex.Acțiunea sa este aceea de a topi ADN-ul dublu catenar de-a lungul unei secvențe de aproximativ 11 bps, de la -9 la +2. Factorul s se desprinde odată cu începerea transcripției.
Factorii s specifici dintr-o celulă sunt cei care determină ce gene vor fi transcrise. Astfel, tipurile individuale de celule sunt caracterizate de factorii lor s.
Alungirea catenei decurge în direcția 5′–> 3′, iar „bula de transcripție” (lungimea de ADN „topit”) se deplasează cu ARN polimeraza. În consecință, ADN-ul netopit este supraînfășurat în fața bulei și subînfășurat în spatele bulei. Topoizomerazele acționează apoi pentru a relaxa superbobinele pozitive și negative. ARNm care este produs este hibridizat pe o lungime scurtă la ADN în poziția din aval și există separat de ADN ca o „coadă”, punctul de atașare fiind la capătul din aval. ARN-polimeraza nu se desprinde de ADN în timpul procesării, datorită legăturii sale relativ strânse, dar nespecifice, pe ambele părți ale bulei de transcripție, stabilizată de „degetul mare” care se înfășoară în jurul ADN-ului. Aproximativ 20 până la 50 de nucleotide sunt transcrise pe secundă la 37 C și un nucleotid este transcris incorect la aproximativ fiecare 104 . Având în vedere că genele sunt transcrise în mod repetat, această rată de eroare nu este prea dăunătoare, mai ales dacă este asociată cu faptul că există mai mulți codoni („sinonime”) pentru fiecare aminoacid tradus ulterior și că erorile de substituție a unui singur aminoacid într-o proteină nu împiedică, de obicei, funcționarea acesteia.
Terminarea spontană a transcrierii genelor este semnalată prin „secvențe de terminare”.La E.coli, semnalul final de oprire a transcrierii este reprezentat de o serie de 4 – 10 perechi de baze A-T cu A din șirul șablonului șablon. Pentru fiecare A din această regiune, transcrierea ARNm va avea un U. Chiar în amonte de această secvență se află o regiune bogată în baze Gand C, urmată de un distanțier de nucleotide și o altă regiune bogată în G șiC. Cele două regiuni G,Crich sunt de așa natură încât o regiune poate fi suprapusă peste cealaltă prin operația de asimetrie de 180o . Această relație a perechilor de baze în jurul unui centru de simetrie rotațională se numește „secvență palindromică”. Șirul de nucleotide rezultat la capătul 3′ al ARNm este de așa natură încât se poate forma o buclă în formă de ac de păr, în care baza Gs se împerechează cu Cs și viceversa, iar As cu Us. Partea cea mai terminală a capătului 3′ este o serie de Us urmată de o grupare hidroxil.În timp ce se formează bucla, ARN polimeraza se oprește la locul de terminare. Coada terminală a oligo-U, care este doar slab legată de șirul șablon ADN șablon, este deplasată de șirul de ADN care nu este șablon.Acum, șirul de ARNm este liber de șablonul ADN. Cu toate acestea, există numeroși alți factori care influențează procesul general de terminare.
Terminarea nepontană a transcripției necesită o proteină „factor rho”, care funcționează, de asemenea, pentru a îmbunătăți eficiența terminării spontane.Factorul rho recunoaște o secvență pe lanțul de ARNm în creștere, în amonte de situsul de terminare, după care se atașează și se deplasează de-a lungul lanțului în direcția 5′-3′ până când ajunge la ARN polimeraza care este în pauză la situsul de terminare. Transcriptul este eliberat de șirul șablon prin dezlegarea duplexului ARN-ADN de către factorul rho.
Transcripția la eucariote:
În timp ce este foarte asemănătoare cu cea de la procariote, „mașinăria” și secvențele de control ale transcripției la eucariote este mult mai complexă și există numeroase ARN polimeraze.
ARN-ul ribozomal (ARNr) constituie aproximativ 95% din tot ARN-ul și aproximativ 67% din ARN-ul din ribozomi. Restul ARN-ului include ARN de transfer (ARNt), ARN mesager (ARNm) și alte tipuri prezente în cantități mai mici, cum ar fi ARN „smallnuclear” (snRNAs) implicat în splicingul ARNm și ARN „ghid” care sunt implicate în editarea ARN-ului. Aceste din urmă două procese au loc în traducerea de după DeepL din ciclul de viață al ARNm eucariot. Toate ARN-urile sunt codificate de ADN, iar diferitele tipuri de ARN polimerază la eucariote reflectă acest lucru și faptul că, la eucariote, traducerea ARNm în ADN are loc în afara nucleului.
Precursorii majorității ARNr sunt sintetizați în nucleoli cu ajutorul enzimei ARNpolimeraza I. Precursorii ARNm sunt sintetizați în nucleoplasmă de către ARNpolimeraza II, în timp ce ARN polimeraza III, tot în nucleoplasmă, sintetizează precursorii ARN 5S, ARNt și alte ARN-uri care se găsesc atât în nucleu, cât și în citoplasmă. Mitocondriile au propriile ARN-polimeraze, iar acestea sunt analoage cu ARN-urile din cloroplaste care se găsesc în plante. Ne vom concentra pe ARN polimeraza II, deoarece este cea implicată în transcripție la eucariote.
Vă puteți uita la structura ARN polimerazei II din drojdie (vezi PDB de mai jos), deoarece discutăm despre structura sa ca prototip. Acestea sunt enzime mari, cu mai multe subunități, unele dintre subunități fiind omoloage ale subunităților a, b și b’ din ARN polimeraza procariotă.Forma generală a enzimei este similară cu cea a ARN-polimerazei procariote ( și a ADN-polimerazei), și anume cea a unei mâini cu un motiv de „deget mare” care flanchează un canal suficient de mare pentru a conține o bucată de ADN-B (aproximativ 25 A lățime).
1ENO: ARN Polimeraza II a ARN-polimerazei de drojdie
Nu am luat încă în considerare chimia alungării lanțului de ARNm, dar o vom face aici. Lanțurile sunt alungite în direcția 5′–> 3′ prin atacul nucleofilic al grupei OH 3′ a lanțului în creștere de către a-fosfatul din NTP-ul sosit.
Ca și la procariote, transcripția eucariotă începe prin recunoașterea unor promotori. Există mai multe copii ale genelor ARNr care dirijează sinteza ARNr,toate cu secvențe aproape identice. Această redundanță asigură o aprovizionare adecvată cu ARNr care, așa cum am menționat anterior, cuprinde aproximativ 95% din ARN celular.Promotorii pentru aceste gene aproape identice sunt, prin urmare, identici, astfel încât ARNpolimeraza I trebuie să recunoască o singură secvență de promotor. Cu toate acestea, ARN-polimeraza I este specifică speciei (ARN-polimeraza II și III nu sunt specifice speciei).
Pentru promotorul ARNr de mamifere,, există un „core promoterelement” care se întinde în regiunea de la -31 la +6 (rețineți că aceasta se suprapune peste o regiune a genei care este transcrisă) și un „element promotor în amonte „care se întinde de la -187 la -107.
Pentru transcrierea genelor de către ARN polimeraza III, promotorul este uneori localizat într-un segment din interiorul părții transcrise a genei, între +40 și +80, dar poate fi, de asemenea, parțial în amonte sau în întregime în amonte de locul de pornire.
Promotoare și secvențe de control ale ARN polimerazei II
Secvențele promotoare pentru ARN polimeraza II sunt diverse. Le putem împărți în două clase: cele care se găsesc în genele care produc proteine cam la aceeași rată în toate celulele („enzime constitutive”) și cele pentru genele ale căror rate de producție variază foarte mult de la un tip celular la altul și depind de nevoile unei celule diferențiate la un moment dat („enzime inductibile”).
Elemente promotoare constitutive ale genelor:
Cutia GC: Aceasta este o regiune care conține una sau mai multe copii ale secvenței GGGCGG (sau complementul acesteia) într-o locație în amonte de situsul de start și este analogă cu elementele promotoare procariote.
Alte elemente promotoare se găsesc, de asemenea, în regiunea cuprinsă între -50 și – 110, în amonte de caseta GC.
Elemente promotoare ale genelor cu expresie selectivă:
Caseta TATA : Regiune situată la aproximativ -25 până la -30, care este bogată în nucleotide „A” și „T” și care seamănă cu caseta Pribnow (TATAAT). Genele pot fi încă transcrise în prezența unei cutii TATA defecte și se crede că această cutie TATA este implicată în alegerea situsului de început al transcripției
Cutia CCAAT: Aceasta este o secvență care se găsește adesea în amonte de cutia TATA, localizată la aproximativ -70 la 90. Acestea se leagă de ARN polimeraza II, precum și de alte proteine necesare pentruinițierea transcripției.
Secvențe de control pentru genele structurale:
Alte regiuni ale cromozomului, unele foarte îndepărtate de situsul de start, pot afecta legarea ARN polimerazei II la elementele promotoare. Aceste elemente genetice se numesc „enhanceri” și „silențiatori”. Proteinele numite „activatori” și „reprimatori” se pot lega de potențiatori și silențiatori, afectând astfel legarea polimerazei la promotori. Mai mult,aceeași proteină poate funcționa atât ca activator, cât și ca represor, în funcție de interacțiunea specifică (factori de transcripție cu „dublă acțiune”).
Recrutarea ARN Polimerazei II la promotor:
Eucariotele nu au o proteină simplă care să corespundă factorului s din procariote. Mai degrabă, există un set de proteine care împreună îndeplinesc aceeași funcție ca și factorul s, iar aceștia sunt „factorii generali de transcripție” („GTF”). Ne-am uitat deja la structurile factorilor de transcripție atunci când am discutat despre interacțiunea ADN-proteină într-un curs anterior. Altfel, mecanismele generale de inițiere a transcripției sunt similare.
Există 6 GTF care sunt necesari pentru o rată bazală de transcripție scăzută și invariabilă, iar această rată poate fi crescută prin participarea altor factori proteici. Aceste GTF formează un „complex de preinițiere” care începeîn momentul în care „proteina de legare TATA” („TBP”) se leagă de caseta TATA (dacă există una) a unui promotor. Secvența specifică la care se leagă identifică locul de început al transcripției. Ca urmare a acestei legături, ADN-ul este distorsionat prin îndoiri la ambele capete ale cutiei TATA. Alte GTF-uri se leagă în mod succesiv, urmate de legarea ARN polimerazei. În cele din urmă, restul GTF-urilor se leagă.
1YTB: Complexul TBP/TATA Box
După ce TBP (care este o componentă a TFIID) se leagă, secvența de legare este după cum urmează:
TFIIA
TFIIB
TFIIF
ARN PII
TFIIE
TFIIH
TFIIH are două activități enzimatice importante. Prima este o activitate de helicază dependentă de ATP care ajută la formarea unui complex deschis, iar cea de-a doua este o activitate de kinază care are ca rezultat fosforilarea celei mai mari subunități a ARN polimerazei II la capătul său C-terminal. Acum poate începe procesul de alungire a transcripției, diferitele GTF-uri (cu excepția TFIIF) disociindu-se din complex pe măsură ce are loc alungirea. TFIID rămâne legat de promotor, astfel încât transcrierea repetată poate avea loc pe măsură ce GTF-urile se reasamblează pentru a forma complexul de preinițiere.
Această discuție s-a axat pe ARN polimeraza II; pentru ARN polimerazele I și III sunt necesari factori de transcriere diferiți. Cu toate acestea, toate trei necesită TBP.
Celele controlează transcrierea fiecărei gene în parte. O combinație unică de silențiatori și intensificatori pentru fiecare genă modulează rata de transcripție. Cum influențează proteinele activatoare și represoare care sunt legate departe de promotor această transcriere a genelor?
„Proteina de specificitate 1” (Sp1) a fost primul factor de transcripție uman care a fost găsit care putea recunoaște o secvență specifică de enhancer GCregulator. Această proteină are două module interesante:
(1) Un modul cu 3 degete de zinc la un capăt;
(2) Un modul la capătul opus cu 2 segmente discrete bogate în Gln.
Mutanții care nu au capătul bogat în glutamină se pot lega de ADN, dartranscrierea nu este stimulată. Prin urmare, capătul bogat în glutamină trebuie să trebuiască să se lege de altceva pentru ca transcripția să aibă loc, iar aceștia sunt „coactivatorii”. ei se mai numesc și „factori asistați de TBP” sau „TAF” șiexistă cel puțin opt dintre ei care sunt importanți pentru activarea transcripției. Aceștia nu sunt factori bazali (GTF) și nu se leagă de secvențe specifice de ADN. Mai degrabă, ei se leagă cu aviditate la TBP și asigură „situsuri de andocare” multiple pentru activatori. În acest sens, aceștia sunt „molecule adaptoare”. Un „set de instrumente” de astfel de molecule adaptoare oferă o diversitate extraordinară de opțiuni pentru a modula transcrierea unei gene. Așadar, extinzând comparația noastră anterioară între complexul de preinițiere al GTF-urilor și factorul s procariotic, o comparație mai bună ar fi între factorul s și întregul complex de preinițiere activator-coactivator-basal. În ceea ce privește modul în care acest aranjament modulează sau influențează rata de transcripție, acesta este probabil mediat în primul rând de o distorsiune a ADN-ului care facilitează mișcarea ARN polimerazei II de-a lungul regiunii de codificare.
Latchman (TRENDS in Biochemical Sciences Vol. 26 No.4 Aprilie 2001) a subliniat importanța situsului de legare a ADN-ului în sine ca jucând un rol cheie în modulația intranscripțională. Același factor de transcripție poate lua diferite conformații ca rezultat al legării la diferite situsuri. Modificările de conformație sunt induse de interacțiunea ADN-proteină, crescând astfel flexibilitatea spectrului de control al transcripției, deoarece o singură proteină poate acționa ca o întreagă colecție de proteine, fiecare având propriul efect (activare, inhibare sau niciun efect).
Pentru a duce acest lucru cu un pas mai departe, ne putem imagina că un fenomen similar poate avea loc atunci când coactivatorii se leagă de activatori. Poate că diferite modificări conformaționale sunt induse în mod similar în proteina legată în funcție de tipul de interacțiune proteină-proteină. Astfel de modificări conformaționale pot rezulta apoi o capacitate indiferentă de a modula transcripția.
Domeniile de activare ale factorilor de transcripție sunt adesea bogate în glutamină, dar altele sunt bogate în prolină sau acide. În unele cazuri, resturile hidrofobe sunt intercalate printre resturile acide sau glutaminice și sunt importante pentru activare. Tjian (Cell, Vol. 77, 5-8, 8 aprilie 1994) sugerează că forțele hidrofobe conduc coeziunea domeniilor de activare cu țintele lor și că specificitatea este obținută prin periodicitatea elementelor coezive.
Genele sunt transcrise la rate măsurabile numai dacă activatorii corecți sunt prezenți și sunt capabili să depășească efectele reprimatorilor.
.