Patogénesis in vitro
Las células epiteliales columnares son células sin salida que experimentan dos extremos de pH a la vez. Apicalmente, están bañadas en fluidos intestinales altamente alcalinos y basalmente están bañadas en hemolinfa ligeramente ácida. Estas condiciones son difíciles de imitar en el cultivo celular, un hecho que puede explicar la escasa información disponible sobre la infección primaria.
Las líneas celulares que soportan la replicación del GV son raras y actualmente sólo existen para el CpGV. En consecuencia, sabemos poco más sobre los mecanismos de la infección por el GV que sobre la infección por el ODV. Aun así, sabemos que durante la morfogénesis de la nucleocápside del GV, la membrana nuclear de la célula huésped se desintegra, un evento que no interrumpe el procesamiento de la nucleocápside. La desaparición de la membrana nuclear es característica y no se produce en las células huésped infectadas por NPV.
Se han establecido varias líneas celulares de insectos que soportan las infecciones por NPV. La mayoría de las líneas celulares se derivan de ovarios o embriones de oruga. El AcMNPV puede replicarse en líneas celulares derivadas de varias especies de insectos, un hecho que contribuye a que sea el baculovirus mejor estudiado. En una curva de crecimiento estándar de un solo paso, los baculovirus AcMNPV suelen producirse entre 12 y 20 horas después de la infección (hpi), y las oclusiones, entre 20 y 48 hpi. La replicación de la mayoría de los otros NPV en cultivo celular tarda de horas a días más.
El AcMNPV BV es 1000 veces más infeccioso que el ODV, principalmente debido a la presencia de su proteína de fusión, GP64. Los BV entran en sus células objetivo por endocitosis mediada por clatrina. Los nucleocápsidos del BV penetran profundamente en el citoplasma de las células objetivo al ser liberados de los endosomas. Mediante esta estrategia, las nucleocápsidas evitan el entorno posiblemente peligroso que se encuentra justo debajo de la membrana plasmática y entran en la célula más cerca del núcleo de lo que permitiría la fusión en la membrana plasmática. Los cambios conformacionales sensibles al pH experimentados por las proteínas de fusión del BV sirven para desencadenar un evento de fusión entre la envoltura viral y la membrana endosomal.
El escape de la nucleocápside del AcMNPV del endosoma es seguido inmediatamente por su asociación con los cables de F-actina. La formación de cables es transitoria y se produce durante el tiempo en que las nucleocápsidas virales se desplazan hacia el núcleo y entran en él. Durante el tránsito, las nucleocápsidas virales se co-localizan con un extremo de un cable de actina, posiblemente a través de P78/83, una proteína de unión a F-actina que se cree que está localizada en la base de las nucleocápsidas. La asociación de las nucleocápsidas con los cables de actina y el retraso de la expresión del gen informador en presencia de fármacos que interrumpen la función de la actina/miosina sugieren que los cables pueden facilitar el transporte de las nucleocápsidas al núcleo, o mediar su paso a través de los poros nucleares.
Las nucleocápsidas del VN y de algunos VG entran en los núcleos a través de los poros nucleares. Algunos GV se descobijan en los poros nucleares, pero la mayoría de los baculovirus se descobijan dentro del núcleo. La transcripción temprana de genes comienza inmediatamente, mediada por la ARN polimerasa II (Pol II) del huésped. Entre los genes tempranos que se expresan hay un subconjunto cuya expresión conduce a un transporte eficiente de G-actina hacia el núcleo y a su acumulación dentro de él (Figura 5). Esta espectacular manipulación de la localización de la actina es crítica para la producción de progenie del VNP y no se ha descrito para ningún otro patógeno. Los genes implicados en la localización nuclear de la actina, identificados en los experimentos de transfección transitoria, incluyen ie1, pe38, Ac004, Ac152, he65 y Ac102. Dos de los genes, ie1 y Ac102, se conservan entre todos los VN y VG de lepidópteros, y ambos son esenciales.
Figura 5. G-actina nuclear en células infectadas por AcMNPV. (a) Células infectadas teñidas con 4′,6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI); (b) célula infectada que expresa la proteína verde fluorescente (GFP)-actina transfectada. (c) La falta de tinción nuclear con rodamina y faloidina indica que la actina nuclear es monomérica.
La transición a la fase tardía de la infección es el comienzo del periodo de producción de progenie de la BV; las actividades celulares están orientadas a sintetizar los componentes virales a tasas máximas, ensamblarlos en productos de la nucleocápside y luego exportarlos. La síntesis macromolecular del huésped se detiene durante este periodo, pero la estructura de la cromatina del huésped permanece intacta hasta la muerte celular. Los genes víricos tardíos y muy tardíos son expresados por una ARN polimerasa codificada por el virus.
Los microtúbulos, reorganizados durante la fase temprana de la infección, son despolimerizados por factores producidos durante la fase tardía que conducen al redondeo celular (Figura 6). Del mismo modo, la G-actina, acumulada en el núcleo durante la fase temprana, se polimeriza durante la fase tardía, coincidiendo con la hinchazón nuclear y la desaparición de las estructuras nucleares visibles del huésped (Figura 7). El estroma virogénico, el lugar de la síntesis del ADN viral, se forma en el centro del núcleo y está intercalado y rodeado por una zona electrónicamente lúcida llamada «zona del anillo», un lugar donde las cápsides se ensamblan y se atan durante la carga del genoma. La F-actina nuclear se co-localiza con la principal proteína de la cápside del AcMNPV en la zona anular (Figura 7).
Figura 6. Células Sf21 infectadas con AcMNPV que demuestran diferentes fases del efecto citopático (CPE). (a) Células no infectadas. Obsérvese la forma de huso y la presencia de estructuras de nucleocromatina. (b) Células infectadas con AcMNPV que muestran un ECP temprano y tardío. Las células se redondean debido a la despolimerización de los microtúbulos, los núcleos son más grandes y están libres de estructuras del huésped, y el estroma virogénico (vs) está rodeado por la zona anular (rz). Los estromas virogénicos se vuelven más densos a medida que avanza la fase tardía de la infección. Los poliedros llenan el núcleo durante la fase muy tardía de la infección (p).
Figura 7. F-actina nuclear en la célula infectada por AcMNPV durante la expresión génica tardía. (a) La tinción con DAPI indica la localización del núcleo. (b) La fluorescencia verde indica que la proteína de la cápside se localiza principalmente en la zona anular del núcleo. (c) La tinción con rodamina-faloidina muestra que la F-actina se co-localiza con la cápside en la zona anular.
La F-actina nuclear es necesaria para la producción de BV. En presencia de fármacos que alteran la F-actina, las cápsides virales se malforman y aparecen como estructuras tubulares largas yuxtapuestas a la membrana nuclear interna con parches infrecuentes de material denso para los electrones. Las placas base y las estructuras de la cápside normalmente presentes no son evidentes, y se produce un exceso de perfiles membranosos. La síntesis de ADN viral se produce al ritmo normal, pero los genomas no se empaquetan, y el estroma virógeno tiene un aspecto «relajado» en comparación con el estroma normal. Curiosamente, el fenotipo para la ausencia del factor-1 muy tardío del AcMNPV (VLF-1) es similar, lo que sugiere que el VLF-1 puede estar implicado en la fijación de las cápsides al estroma virogénico, y que la F-actina es un componente del estroma al que se unen las cápsides, directa o indirectamente.
P78/83, una proteína menor de la cápside que se expresa tarde durante la infección, es esencial para la viabilidad del AcMNPV. Esta característica se observó hace más de 30 años y se explotó en los primeros kits comerciales de expresión de baculovirus. Se cree que P78/83 (78 kDa cuando no está fosforilada y 83 kDa cuando está fosforilada) forma parte de las placas base de las cápsides tanto del BV como del ODV. P78/83 es una proteína de unión a la F-actina, y esta actividad puede ayudar a unir las cápsides a la matriz nuclear durante el ensamblaje. Curiosamente, P78/83 contiene otra actividad que explica por qué es esencial; promueve la polimerización de actina dentro del núcleo. P78/83 contiene dominios conservados en los miembros de la familia de la proteína del síndrome de Wiskott-Aldrich (WASP), factores que promueven la nucleación de los filamentos de actina. Los miembros de la familia WASP regulan positivamente la actividad nucleadora de actina del complejo Actin Related Protein (Arp)-2/3. El complejo de siete subunidades, conservado en todos los eucariotas, se traslada al núcleo en las células infectadas por el AcMNPV y es activado por P78/83. Las mutaciones en P78/83 que conducen a una disminución de la capacidad de promover la nucleación de la actina conducen a una disminución de la capacidad de producir BV infeccioso.
Inmediatamente después de entrar en el núcleo, el ADN del AcMNPV adopta una estructura similar a la de los nucleosomas y utiliza nucleosomas y procesos relacionados con los nucleosomas en la replicación del genoma. Por lo tanto, un componente de la estrategia de replicación viral parece ser el secuestro de componentes, si no de toda la capacidad de remodelación de la cromatina del huésped. Las pruebas recientes sugieren que la familia de proteínas BRO (baculovirus repeated orf) son probablemente participantes en este proceso. Las proteínas BRO se expresan en las primeras fases de la infección, se unen al ADN monocatenario (ssDNA) y a las histonas del núcleo, y se separan de las histonas en los experimentos de fraccionamiento. El BmNPV, el orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus y el lymantria dispar multiple nucleopolyhedrovirus tienen múltiples genes bro. El AcMNPV sólo lleva un gen bro, relacionado con el bro-d del BmNPV, que es esencial.
La P6.9 codificada por el AcMNPV, la proteína de empaquetamiento del genoma altamente básica, comienza a acumularse durante la última fase de la infección y surge una estructura de cromatina alternativa.
Las interacciones P6.9-ADN están controladas por el estado de fosforilación de P6.9. Durante el empaquetamiento del genoma, el ADN genómico del estroma virogénico se une a P6.9 a medida que P6.9 se desfosforila, condensándose en una vaina de cápside preformada a través de una abertura en una estructura de extremo cónico. Las estructuras cónicas se encuentran en la parte proximal del estroma virogénico, con vainas de la cápside cubiertas por placas base que se extienden en la parte distal hacia un espacio menos denso en electrones, la zona anular. La F-actina y la proteína de la cápside se co-localizan en la zona anular, junto con P78/83 y el complejo Arp2/3. Es esta fase de replicación la que se ve afectada tanto por los fármacos que interrumpen la F-actina como por la ausencia de VLF-1.
Con el inicio de la fase muy tardía de la infección se produce una reducción de la producción de BV y aparece la producción de ODV. Los nucleocápsidos recién ensamblados permanecen dentro del núcleo, donde se envuelven en envolturas que se cree derivan de la membrana nuclear interna. Los viriones envueltos, pero no los nucleocápsidos sin envolver, se ocluyen en una matriz proteica para formar cápsulas o poliedros. Las células acaban lisándose, liberando las oclusiones al medio.