Translace je proces, který zahrnuje syntézu řetězce aminokyselin z předlohy mRNA. Tyto polypeptidové řetězce se skládají do funkčních proteinů. K translaci dochází mimo jádro poté, co je dokončeno jaderné zpracování pre-mRNA a molekuly mRNA jsou jadernými póry transportovány do cytoplazmy. Translaci usnadňují především ribozomy umístěné na drsném endoplazmatickém retikulu, na vnějším povrchu jaderného obalu nebo v cytoplazmě.
- Iniciace
- Prodloužení
- Konec
- Recyklace
Při translaci hraje roli řada molekulárních složek, z nichž nejvýznamnější je ribozom. Tento makromolekulární komplex se skládá z několika proteinů a molekul rRNA. Všechny ribozomy mají malou a velkou podjednotku, avšak složení těchto podjednotek se u jednotlivých druhů podstatně liší. Například u člověka se malá podjednotka 40S skládá z 33 proteinů a jedné molekuly 18S rRNA, zatímco velká podjednotka 60S se skládá ze 47 proteinů a tří rRNA (5S, 5,8S a 28S) .
Přes identifikaci 80 proteinů spojených s lidským ribozomem se jich u jiných eukaryot nebo prokaryot vyskytuje pouze 34 . Zatímco proteinům spojeným s ribozomem byly navrženy obecné funkce, jako je stabilizace komplexu a regulace translace, některým z nich byla přisouzena také ko-translační modifikace nově syntetizovaných proteinů (přehled v ).
Elongace
Na rozdíl od iniciační, terminační a recyklační fáze translace ribozomu jsou mechanismy, které řídí elongaci, mezi eukaryoty a bakteriemi vysoce konzervované (přehled v ).
Rozpoznávání kodonů
Elongace probíhá v několika přesně definovaných krocích, které začínají rozpoznáním kodonů mRNA odpovídající aminoacyl-tRNA. Spojení s mRNA probíhá prostřednictvím ribozomálního místa A a je ovlivňováno různými elongačními faktory. Například GTPáza eEF1A dodává aminoacyl-tRNA do místa A poté, co je aktivována eEF1B, guanin nukleotidovým výměnným faktorem (GEF), který urychluje disociaci GDP z eEF1A .
Tvorba peptidové vazby
Po rozpoznání kodonu mRNA se vytvoří peptidová vazba mezi aminoacyl-tRNA a peptidyl-tRNA (která se nachází v ribozomálním místě P). Tuto reakci usnadňuje peptidyltransferáza, která sama o sobě není proteinem, ale vysoce konzervovanou ribozomální RNA . Mechanismus vzniku peptidové vazby zahrnuje spíše konformační změny v aktivním místě než chemickou katalýzu ribosomálními skupinami a je řízen příznivou změnou entropie .
Translokace mRNA a tRNA přes ribozom
Po vytvoření peptidové vazby se místo A uvolní, když se peptidyl-tRNA, která ho zaujímá, přesune do místa P velké ribozomální podjednotky a současně nahradí stávající deacylovanou tRNA, která se před opuštěním ribozomu přesune do místa E . Jak řetězec aminokyselin roste a místa A a P jsou přechodně obsazena novými aminoacyl-, resp. peptidyl-tRNA, dochází k translokaci mRNA přes ribosom.
Dva mechanismy, které se vyznačují konformačními změnami ribozomálních podjednotek, usnadňují translokaci mRNA a tRNA. Jsou známy jako „ratcheting“ a „swiveling“.
Ratcheting je pozorován ve všech fázích translace a dochází při něm k mírné rotaci malé ribozomální podjednotky, přibližně ~8° vzhledem k velké podjednotce (přehled v ). To se liší od otáčení, které zahrnuje pohyb hlavové domény (30S) malé podjednotky. Důležité je, že otáčení hraje roli ve vlastní helikázové aktivitě ribozomu, která je důležitá pro odvíjení sekundárních struktur mRNA .
Tyto mechanismy v konečném důsledku zajišťují sekvenční pohyb tRNA (z místa A do místa P do místa E) a umožňují vznik mezistavů, o nichž je známo, že existují během translokace mRNA-tRNA. Tyto stavy, které jsou také známy jako hybridní stavy , lze popsat na příkladu eukaryotického modelu. Zde se 3′ konce tRNA obsazující místa A a P přesouvají, aby obsadily místa P a E v podjednotce 60S, zatímco 5′ konce, které jsou spojeny s mRNA, zůstávají ukotveny v místech A, respektive P podjednotky 40S .
Tyto hybridní stavy jsou na okamžik stabilizovány vazbou eEF2-GTP (EF-G – GTP u prokaryot) na ribozomální místo A. V případě, že se tRNA přesouvá na místo A, jsou tyto hybridní stavy stabilizovány. Hydrolýza GTP, která je zprostředkována GTPázovou aktivitou EF-G nebo eukaryotického homologu eEF2, však umožňuje pokračování ráčnovacího mechanismu a způsobuje přesun mRNA a 5′ konců tRNA z míst A a P do míst P, resp. Jakmile se obnoví kanonická konformace A/A, P/P, E/E (60S/40S), EF-G – GDP se oddělí od ribozomu a místo A zůstane otevřené pro novou molekulu aminoacyl-tRNA.
Hydrolýza GTP pomocí EF-G / eEF2 a následné vychýlení hlavové domény dále napomáhá translokaci tRNA tím, že zabraňuje jakémukoli spontánnímu zpětnému pohybu tRNA .
Iniciace translace
První krok translace se nazývá iniciace. Zde dochází k sestavení velké (60S) a malé (40S) ribozomální jednotky do plně funkčního ribozomu 80S. Ten je umístěn na počáteční kodon (AUG) řetězce mRNA, který má být přeložen (přehled v ).
Iniciace je považována za rychlost limitující krok v celém procesu a je primárně regulována a koordinována skupinou proteinů známých jako eukaryotické iniciační faktory (eIF) . Tyto faktory mají různou velikost a složitost; od jediné 113kDa podjednotky eIF1 až po 700kDa komplex eIF3. U člověka funguje při regulaci iniciace ve vzájemné součinnosti nejméně 12 eIF, přičemž každý z nich hraje odlišnou roli, která byla podrobně rozebrána v .
Iniciace začíná vytvořením ternárního komplexu, který se skládá z eIF2, GTP a iniciační tRNA (Met-tRNAi). Primární úlohou ternárního komplexu je dodat iniciátor podjednotce 40S, která následně vytvoří komplex 43S, nazývaný také PIC (preiniciační komplex). S pomocí eIF4G a eIF3 se PIC váže na 5′-konec mRNA nebo do jeho blízkosti. Ten je označen 7-methylguanosinovou čepičkou (m7-G-cap). Po navázání PIC prohledává 5′ nepřekládanou oblast, aby našel iniciační kodon.
Vedoucí sekvence 5′-konce je udržována v nenavinutém stavu helikázovou aktivitou několika eIF (včetně eIF4F, eIF4G, eIF4A, eIF4B, eIF3). Jakmile je podjednotka 40S umístěna na iniciačním kodonu, je rekrutována podjednotka 60S, která vytvoří elongačně kompetentní ribozom 80S. V tomto okamžiku je startovací kodon mRNA lokalizován v ribozomálním místě P a celý iniciační komplex je připraven vstoupit do elongační fáze .
Je důležité poznamenat, že podjednotka 40S se může vázat na mRNA nezávisle na m7-G-cap. Nejvýznamnějším příkladem, který se pravděpodobně vyskytuje u 5-10 % buněčných mRNA, je vazba podjednotky 40S na vnitřní vstupní místo ribozomu (IRES) . Mezi další iniciační cesty nezávislé na m7-G-kapičce patří posunutí , tethering , translační enhancery , element TISU a poly-adenylátový vůdce v 5′-konci .
Recyklace ribozomu
Konečným krokem translace je recyklace ribozomu, při níž se ribozom rozdělí na menší podjednotky a připraví se na další kolo translace. U eukaryot to znamená, že ribozom 80S se rozdělí na podjednotky 40S a 60S. Ačkoli tento krok znamená dokončení procesu translace, může k němu dojít i z různých jiných důvodů, například když selže syntéza polypeptidového řetězce, když se vyskytne poškozená mRNA nebo po sestavení prázdných ribozomů. Kromě toho je tento krok často popisován jako začátek iniciace, přičemž klíčový protein, který usnadňuje štěpení ribozomů, se také spojuje s několika iniciačními faktory (v kvasinkových modelech bylo prokázáno, že ABCE1 se spojuje s eIF2, eIF3 a eIF5 ).
Recyklaci ribozomů u eukaryot usnadňuje především ABCE1 (u kvasinek Rli1), který je členem nadrodiny ATPáz ABC. Tento protein, který má dvě domény vázající nukleotidy a jedinečnou doménu klastru FeS1, se váže na postterminační komplex, jakmile se RF3-GDP oddělí od ribozomu. Tato asociace vzniká interakcí mezi FeS klastrem a eRF1. Důležité je, že ACBE1 obsahuje také četná vazebná místa, která umožňují interakce mezi ribozomálními podjednotkami a různými ribozomálními proteiny. Například bylo prokázáno, že motiv HLH v první nukleotidové vazebné doméně se váže na 18S rRNA i na rpS24-A . Ačkoli přesný mechanismus, který řídí ribozomální štěpení, zůstává nejasný, předpokládá se, že u eukaryot je výsledkem konformační změny v ABCE1, která je vyvolána hydrolýzou ATP.
Jak již bylo uvedeno, uvolnění peptidů není podmínkou pro disociaci ribozomálních podjednotek ani pro vazbu ABCE1 . To je důležité, když je recyklace ribozomů indukována v reakci na poškození mRNA nebo sestavení volných ribozomů, protože nebude detekován stop-kodon, který by inicioval terminaci a uvolnění peptidu. K překonání tohoto problému je ABCE1 schopen usnadnit uvolňování peptidů podobným způsobem jako ternární komplex eRF1-eRF3-GTP a bylo prokázáno, že k tomu dochází nezávisle na hydrolýze ATP. Zde hydrolýza ATP vyvolává konformační změnu v eRF1, která podporuje hydrolýzu peptidyl-tRNA .
Důležité je, že eRF1 a eRF3 mohou stačit k zahájení disociace podjednotky; ta však bude probíhat pomaleji .
Mechanismy recyklace u prokaryot se liší od mechanismů u eukaryot, přičemž hlavním rozdílem je přítomnost specializovaného faktoru recyklace ribozomů (RRF), který u bakterií působí společně s EF-G při oddělování ribozomálních podjednotek .
Terminace translace
Dalším krokem v procesu translace je terminace. V tomto kroku stop kodon mRNA signalizuje, že do rostoucího proteinu nemají být přidány žádné další aminokyseliny. Terminace u eukaryot je umožněna pouze dvěma faktory (eRF1 a eRF3) a výrazně se liší od procesu u prokaryot, který zahrnuje tři faktory (RF1, RF2 a RF3) . U eukaryot musí proběhnout dva odlišné procesy, aby byla peptidová elongace úspěšně ukončena: uvolnění peptidu a vytvoření postterminačního komplexu. V některých případech, kdy musí být translace ukončena před detekcí stop kodonu, může být krok ukončení přeskočen a recyklace ribozomu zahájena dříve. V takovém případě uvolnění peptidu usnadní ABCE1 .
Terminace je spuštěna vstupem stop kodonu (UAA, UGA nebo UAG) do ribozomálního místa A. V takovém případě je uvolnění peptidu usnadněno pomocí ABCE1. Tento kodon je rozpoznán uvolňovacím faktorem třídy 1 (RF1). U eukaryot se tento faktor (eRF1) váže na ribosom jako součást předem sestaveného ternárního komplexu složeného z eRF1, eRF3 a GTP . Stop-kodon je rozpoznáván konzervovanými motivy umístěnými na amino-terminálním konci proteinu, jako je motiv NIKS .
eRF1 také pomáhá při hydrolýze peptidyl-tRNA a uvolňování peptidů z peptidyltransferázového centra (PTC). K tomu dochází v důsledku hydrolýzy GTP pomocí eRF3, která vyvolá konformační změnu v eRF1, která umožní jeho Gly-Gly-Gln (GGQ) motivu, který se nachází ve „střední“ (M) doméně, vstoupit do ribozomálního PTC a usnadnit hydrolýzu peptidyl-tRNA. Tento mechanismus se liší u prokaryot, kde je uvolnění peptidu vyžadováno, a tedy předchází hydrolýze GTP pomocí RF3 .
Po hydrolýze GTP a uvolnění peptidu dojde k disociaci RF3-GDP od proteinu a zůstane RF1, který zůstává vázán na ribozom v tzv. postterminačním komplexu . Tím se ribozom v podstatě připraví na ribozomální recyklaci
.