Translaatio on prosessi, jossa aminohappoketju syntetisoidaan mRNA-piirroksesta. Nämä polypeptidiketjut taittuvat toimiviksi proteiineiksi. Translaatio tapahtuu ytimen ulkopuolella, kun pre-mRNA:n ydinprosessointi on saatu päätökseen ja mRNA-molekyylit ovat kulkeutuneet sytoplasmaan ydinhuokosten kautta. Translaatiota helpottavat pääasiassa ribosomit, jotka sijaitsevat karkeassa endoplasmisessa retikulumissa, ydinkuoren ulkopinnalla tai sytoplasmassa.
- Initiaatio
- Pidennys
- Terminaatio
- Kierrättäminen
- Kierrättäminen
Translaatiossa on useita molekyylikomponentteja, joista merkittävin on ribosomi. Tämä makromolekyylikompleksi koostuu useista proteiineista ja rRNA-molekyyleistä. Kaikissa ribosomeissa on pieni ja suuri alayksikkö, mutta näiden alayksiköiden koostumus vaihtelee huomattavasti lajien välillä. Esimerkiksi ihmisellä pieni 40S-alayksikkö koostuu 33 proteiinista ja yhdestä 18S-rRNA-molekyylistä, kun taas suuri 60S-alayksikkö koostuu 47 proteiinista ja kolmesta rRNA-molekyylistä (5S, 5,8S ja 28S) .
Henkilön ribosomiin liittyy 80 proteiinia, mutta muissa eukaryooteissa tai prokaryooteissa niitä on vain 34 . Ribosomiin assosioituneille proteiineille on ehdotettu yleisiä tehtäviä, kuten kompleksin stabilointia ja translaation säätelyä, mutta joidenkin niistä on myös katsottu liittyvän vastasyntetisoitujen proteiinien yhteistranslationaaliseen modifikaatioon (tarkasteltu artikkelissa ).
Elongaatio
Translaation initiaatio-, terminaatio- ja ribosomikierrätysvaiheiden vastakohdaksi on ehdotettu mekanismeja, jotka ohjaavat elongaatiota, mutta ne ovat hyvin konservoituja eukaryooteissa ja bakteereissa eri puolilla (tarkasteltu artikkelissa ).
Kodonin tunnistaminen
Pidennys tapahtuu useissa tarkoin määritellyissä vaiheissa, jotka alkavat mRNA:n koodonien tunnistamisesta niitä vastaavalla aminoasyyli-tRNA:lla. Yhdistyminen mRNA:han tapahtuu ribosomaalisen A-kohdan kautta, ja siihen vaikuttavat erilaiset pidennystekijät. Esimerkiksi GTPaasi eEF1A toimittaa aminoasyyli-tRNA:t A-kohtaan sen jälkeen, kun se on aktivoitunut eEF1B:n toimesta, joka on guaniininukleotidien vaihtotekijä (GEF), joka nopeuttaa GDP:n dissosioitumista eEF1A:sta.
Peptidisidoksen muodostuminen
MRNA:n koodonin tunnistamisen jälkeen aminoasyyli-tRNA:n ja peptidyyli-tRNA:n (joka sijaitsee ribosomaalisessa P-kohdassa) välille muodostuu peptidisidos. Tätä reaktiota helpottaa peptidyylitransferaasi, joka itsessään ei ole proteiini, vaan erittäin konservoitunut ribosomaalinen RNA . Peptidisidoksen muodostumisen mekanismiin liittyy aktiivisen paikan konformaatiomuutoksia eikä niinkään ribosomiryhmien kemiallista katalyysiä, ja sitä ohjaa suotuisa entropian muutos .
mRNA:n ja tRNA:n siirtyminen ribosomin läpi
Kun peptidisidos on muodostunut, A-kohta vapautuu, kun sitä miehittävä peptidyyli-tRNA siirtyy suuren ribosomaalisen alayksikön P-kohtaan ja korvaa samalla olemassa olevan deasyloituneen tRNA:n, joka siirtyy E-kohtaan ennen ribosomista poistumista . Kun aminohappoketju kasvaa ja uudet aminoasyyli- ja peptidyyli-tRNA:t valtaavat ohimenevästi A- ja P-paikat, tapahtuu mRNA:n siirtyminen ribosomin läpi.
Kaksi mekanismia, joille on ominaista ribosomaalisten alayksiköiden konformaatiomuutokset, helpottavat mRNA:n ja tRNA:n translokaatiota. Nämä tunnetaan nimillä ”ratcheting” ja ”swiveling”.
Ratchetingia havaitaan translaation kaikissa vaiheissa, ja siinä pieni ribosomaalinen alayksikkö käy läpi lievän, noin ~8°:n pyörähdyksen suhteessa suureen alayksikköön (tarkasteltu artikkelissa ). Tämä eroaa kääntymisestä, johon liittyy pienen alayksikön pään domeenin (30S) liike. On tärkeää, että kääntymisellä on merkitystä ribosomin sisäiselle helikaasiaktiivisuudelle, joka on tärkeää sekundaaristen mRNA-rakenteiden purkautumisen kannalta.
Nämä mekanismit varmistavat viime kädessä sen, että tRNA liikkuu peräkkäin (A-kohdasta P-kohtaan E-kohtaan), ja mahdollistavat niiden välitilojen muodostumisen, joiden tiedetään olevan olemassa mRNA-tRNA-translokaation aikana. Näitä tiloja, joita kutsutaan myös hybriditiloiksi , voidaan kuvata käyttämällä esimerkkinä eukaryoottimallia. Tällöin A- ja P-paikkoja miehittävät tRNA:n 3′ päät siirtyvät 60S-alayksikön P- ja E-paikoille, kun taas mRNA:han liittyvät 5′ päät pysyvät ankkuroituneina 40S-alayksikön A- ja P-paikkoihin .
Nämä hybriditilat stabiloituvat hetkellisesti eEF2-GTP:n (prokaryooteissa EF-G-GTP) sitoutuessa ribosomaaliseen A-paikkaan. GTP:n hydrolyysi, jota välittää EF-G:n tai eukaryoottien homologin eEF2:n GTPaasiaktiivisuus, sallii kuitenkin ratcheting-mekanismin jatkumisen ja saa mRNA:n ja tRNA:n 5′-päiden siirtymään A- ja P-paikoista P- ja E-paikkoihin. Kun kanoninen A/A, P/P, E/E (60S/40S) -konformaatio on palautunut, EF-G – GDP dissosioituu ribosomista, jolloin A-kohta jää avoimeksi uuden aminoasyyli-tRNA-molekyylin vastaanottamista varten.
GTP:n hydrolyysi EF-G / eEF2:n toimesta ja sitä seuraava pään domeenin kääntyminen auttaa edelleen tRNA:n translokaatiota estämällä tRNA:n spontaanin taaksepäin suuntautuvan liikkeen .
Translaation initiaatio
Translaation ensimmäistä vaihetta kutsutaan initiaatioksi. Tässä vaiheessa suuret (60S) ja pienet (40S) ribosomayksiköt kootaan täysin toimivaksi 80S-ribosomiksi. Tämä asettuu käännettävän mRNA-juosteen aloituskodonin (AUG) kohdalle (tarkasteltu artikkelissa ).
Initiaatiota pidetään nopeutta rajoittavana vaiheena kokonaisprosessissa, ja sitä säätelee ja koordinoi ensisijaisesti ryhmä proteiineja, joita kutsutaan eukaryoottisiksi initiaatiotekijöiksi (eIF) . Näiden tekijöiden koko ja monimutkaisuus vaihtelevat 113 kDa:n eIF1-alayksiköstä 700 kDa:n eIF3-kompleksiin. Ihmisillä ainakin 12 eIF:ää toimii yhdessä initiaation säätelyssä, ja jokaisella niistä on oma tehtävänsä, jota on tarkasteltu laajasti .
Initiaatio alkaa muodostamalla ternäärinen kompleksi, joka koostuu eIF2:sta, GTP:stä ja initiaattori-tRNA:sta (Met-tRNAi). Ternäärisen kompleksin ensisijainen tehtävä on toimittaa initiaattori 40S-alayksikölle, joka myöhemmin muodostaa 43S-kompleksin, jota kutsutaan myös PIC:ksi (pre-initiation complex). PIC sitoutuu eIF4G:n ja eIF3:n avustuksella mRNA:n 5′-terminaaliin tai sen lähelle. Tämä on merkitty 7-metyyliguanosiinikapilla (m7-G-kap). Kun PIC on sitoutunut, se skannaa 5′ kääntämätöntä aluetta löytääkseen initiaatiokodonin.
Useiden eIF:ien (mm. eIF4F, eIF4G, eIF4A, eIF4B, eIF3) helikaasiaktiivisuus pitää 5′-terminaalin johtavan sekvenssin kelautumattomana. Kun 40S-alayksikkö on sijoittunut initiaatiokodonin kohdalle, 60S-alayksikkö rekrytoituu muodostamaan elongaatiokompetentin 80S-ribosomin. Tässä vaiheessa mRNA:n aloituskodoni on paikallistettu ribosomaaliseen P-kohtaan, ja koko initiaatiokompleksi on valmis siirtymään elongaatiovaiheeseen .
On tärkeää huomata, että 40S-alayksikkö voi sitoutua mRNA:han m7-G-capista riippumatta. Merkittävin esimerkki tästä, jonka uskotaan esiintyvän 5-10 %:ssa solujen mRNA:ista, on 40S-alayksikön sitoutuminen sisäiseen ribosomin sisäänmenokohtaan (IRES) . Muita m7-G-kapista riippumattomia initiaatioväyliä ovat shunting , tethering , translaation tehostajat , TISU-elementti ja polyadenylaattijohtaja 5′-terminuksessa.
Ribosomin kierrätys
Translaation viimeinen vaihe on ribosomin kierrätys, jossa ribosomi hajoaa pienempiin alayksikön osiin ja valmistautuu uutta translaatiokierrosta varten. Eukaryooteissa tämä tarkoittaa, että 80S-ribosomi jakautuu 40S- ja 60S-alayksiköihin. Vaikka tämä vaihe merkitsee translaatioprosessin päättymistä, se voi tapahtua myös monista muista syistä, esimerkiksi kun polypeptidiketjun synteesi epäonnistuu, kun mRNA on vaurioitunut tai kun tyhjät ribosomit on koottu. Lisäksi tätä vaihetta kuvataan usein initiaation alkamisvaiheeksi, sillä avainproteiini, joka helpottaa ribosomien jakautumista, assosioituu myös useiden initiaatiotekijöiden kanssa (ABCE1:n on osoitettu assosioituvan eIF2:n, eIF3:n ja eIF5:n kanssa hiivamalleissa ).
Eukaryooteissa ribosomien kierrätystä helpottaa ensisijaisesti ABCE1 (hiivassa Rli1), joka kuuluu ABC-ATPaasien superperheeseen. Tämä proteiini, jolla on kaksi nukleotideja sitovaa domeenia ja ainutlaatuinen FeS1-klusteridomeeni, sitoutuu lopetuksen jälkeiseen kompleksiin, kun RF3-GDP on dissosioitunut ribosomista. Tämä assosiaatio muodostuu FeS-klusterin ja eRF1:n välisen vuorovaikutuksen kautta. On tärkeää, että ACBE1 sisältää myös lukuisia sitoutumiskohtia, jotka mahdollistavat vuorovaikutuksen ribosomaalisten alayksiköiden ja eri ribosomiproteiinien välillä. Esimerkiksi ensimmäisen nukleotidia sitovan domeenin HLH-motiivin on osoitettu sitoutuvan 18S rRNA:han sekä rpS24-A:han. Vaikka ribosomaalista jakautumista ohjaava tarkka mekanismi on edelleen epäselvä, on ehdotettu, että eukaryooteissa se on seurausta ABCE1:n konformaatiomuutoksesta, jonka ATP-hydrolyysi saa aikaan.
Kuten aiemmin mainittiin, peptidin vapautuminen ei ole edellytys ribosomaalisten alayksiköiden dissosioitumiselle tai ABCE1:n sitoutumiselle . Tämä on tärkeää, kun ribosomien kierrätys indusoituu vastauksena mRNA-vaurioon tai tyhjien ribosomien kokoamiseen, koska stop-kodonia ei havaita terminaation ja peptidin vapautumisen käynnistämiseksi. Tämän ongelman ratkaisemiseksi ABCE1 pystyy helpottamaan peptidin vapautumista samalla tavalla kuin eRF1-eRF3-GTP ternäärinen kompleksi, ja tämän on osoitettu tapahtuvan ATP-hydrolyysistä riippumatta. Tässä ATP-hydrolyysi aiheuttaa eRF1:ssä konformaatiomuutoksen, joka edistää peptidyyli-tRNA:n hydrolyysiä .
Tärkeää on, että eRF1 ja eRF3 voivat riittää alayksikön dissosioitumisen käynnistämiseen; tämä tapahtuu kuitenkin hitaammin .
Prokaryoottien kierrätysmekanismit eroavat eukaryoottien mekanismeista, ja tärkein ero on erikoistuneen ribosomin kierrätystekijän (RRF) läsnäolo, joka toimii yhdessä EF-G:n kanssa ribosomaalisten alayksiköiden erottamiseksi bakteereissa .
Translaation päättyminen
Translaatioprosessin seuraava vaihe on translaation päättyminen . Tässä vaiheessa mRNA:n stop-kodoni osoittaa, että kasvavaan proteiiniin ei lisätä lisää aminohappoja. Terminaatiota eukaryooteissa helpottaa vain kaksi tekijää (eRF1 ja eRF3), ja se eroaa merkittävästi prokaryoottien prosessista, jossa on mukana kolme tekijää (RF1, RF2 ja RF3) . Eukaryooteissa on tapahduttava kaksi erillistä prosessia, jotta peptidipidennyksen päättyminen onnistuisi: peptidin vapautuminen ja päättymisen jälkeisen kompleksin muodostuminen. Joissakin tapauksissa, joissa translaation on päätyttävä ennen stop-kodonin havaitsemista, lopetusvaihe voidaan jättää väliin ja ribosomin kierrätys aloittaa varhain. Tällöin ABCE1 helpottaa peptidin vapautumista.
Terminaatio käynnistyy, kun stop-kodoni (UAA, UGA tai UAG) tulee ribosomaaliseen A-kohtaan. Tämän koodonin tunnistaa luokan 1 vapautumistekijä (RF1). Eukaryooteissa tämä tekijä (eRF1) sitoutuu ribosomiin osana valmiiksi koottua kolmikompleksia, joka koostuu eRF1:stä, eRF3:sta ja GTP:stä. Stop-kodoni tunnistetaan konservoituneilla motiiveilla, jotka sijaitsevat proteiinin aminoterminaalisessa päässä, kuten NIKS-motiivilla .
eRF1 avustaa myös peptidyyli-tRNA:n hydrolyysissä ja peptidin vapautumisessa peptidyylitransferaasikeskuksesta (PTC). Tämä tapahtuu eRF3:n suorittaman GTP-hydrolyysin seurauksena, joka indusoi eRF1:ssä konformaatiomuutoksen, joka mahdollistaa sen Gly-Gly-Gln (GGQ) -motiivin, joka sijaitsee ”keskimmäisessä” (M) domeenissa, pääsyn ribosomaaliseen PTC:hen ja helpottaa peptidyyli-tRNA:n hydrolyysiä. Tämä mekanismi eroaa prokaryooteissa, joissa peptidin vapautuminen edellyttää RF3:n suorittamaa GTP-hydrolyysiä ja edeltää sitä.
GTP-hydrolyysin ja peptidin vapautumisen jälkeen RF3-GDP dissosioituu proteiinista jättäen jälkeensä RF1:n, joka pysyy sidottuna ribosomiin niin sanotussa post-terminaatiokompleksissa . Tämä pohjimmiltaan valmistelee ribosomia ribosomaalista kierrätystä varten.