Emzymová imunosorbční analýza (ELISA) je imunologický test běžně používaný k měření protilátek, antigenů, proteinů a glykoproteinů v biologických vzorcích. Některé příklady zahrnují: diagnostiku infekce HIV, těhotenské testy a měření cytokinů nebo rozpustných receptorů v buněčném supernatantu nebo séru. Testy ELISA se obvykle provádějí na 96jamkových destičkách, což umožňuje měření více vzorků v rámci jednoho experimentu. Tyto destičky musí být speciální absorpční destičky (např. destičky NUNC Immuno), aby se zajistilo, že protilátka nebo antigen ulpí na povrchu. Každá metoda ELISA měří specifický antigen a soupravy pro různé antigeny jsou široce dostupné.
Tato metoda ELISA zobrazená na obrázku 1 je tzv. sendvičová metoda ELISA, zde se k detekci vylučovaných produktů, např. cytokinů, používají dvě sady protilátek. Metoda je postupná v zobrazeném pořadí. Prvním krokem je pokrytí destičky ELISA záchytnou protilátkou, přebytečná nenavázaná protilátka se pak z destičky vymyje. Záchytná protilátka je protilátka zvýšená proti antigenu, který je předmětem zájmu.
Obrázek 1. Záchytná protilátka je protilátka zvýšená proti antigenu, který je předmětem zájmu. Metoda ELISA. Výše je popsán sendvičový test ELISA, který znázorňuje jednotlivé kroky testu očíslované v pořadí 1-4.
Následuje přidání vzorku (např. moči, séra nebo buněčného supernatantu). Jakýkoli antigen nalezený ve vzorku se naváže na záchytnou protilátku, která již pokrývá destičku. Vzorky se obvykle přidávají ve dvou nebo třech opakováních (aby bylo možné provést statistickou analýzu) a v různých koncentracích, aby bylo zaručeno, že spadají do úrovně detekce testu. Přebytečný vzorek se opět z destičky vymyje.
V kroku 3 se přidá detekční protilátka. Tato protilátka je značena enzymem, obvykle koňskou peroxidázou nebo alkalickou fosfatázou. Detekční protilátka se váže na jakýkoli cílový antigen již navázaný na destičce. Nakonec se na destičku přidá substrát. Testy ELISA jsou obvykle chromogenní a využívají reakci, při níž se substrát (např. TMB nebo ABTS) přemění na barevný produkt, který lze měřit pomocí čtečky na destičce.
Stanovení koncentrace antigenu ve vzorku vyžaduje vytvoření standardní křivky pomocí antigenů o známé koncentraci (znázorněno na obrázku 2). Koncentraci antigenu ve vzorku pak lze vypočítat pomocí optické hustoty (OD).
Obrázek 2. Typická standardní křivka. Zobrazena je standardní křivka pro test IFN-γ ELISA. Pro stanovení koncentrace antigenu ve vzorku je třeba připravit standardní křivku pomocí roztoku o známé koncentraci.
.