L’enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) è un test immunologico comunemente usato per misurare anticorpi, antigeni, proteine e glicoproteine in campioni biologici. Alcuni esempi includono: diagnosi di infezione da HIV, test di gravidanza e misurazione di citochine o recettori solubili nel surnatante cellulare o nel siero. I saggi ELISA sono generalmente eseguiti in piastre da 96 pozzetti, permettendo di misurare più campioni in un unico esperimento. Queste piastre devono essere piastre assorbenti speciali (ad esempio le piastre NUNC Immuno) per garantire che l’anticorpo o l’antigene aderisca alla superficie. Ogni ELISA misura un antigene specifico, e i kit per una varietà di antigeni sono ampiamente disponibili.
L’ELISA illustrato nella Figura 1 è ciò che è noto come un ELISA a sandwich, qui due serie di anticorpi sono utilizzati per rilevare i prodotti secreti, ad esempio le citochine. Il metodo è graduale nell’ordine indicato. Il primo passo è quello di rivestire la piastra ELISA con l’anticorpo di cattura, ogni eccesso di anticorpo non legato viene poi lavato dalla piastra. L’anticorpo di cattura è un anticorpo cresciuto contro l’antigene di interesse.
Figura 1. Metodo ELISA. Descritto sopra è un ELISA a sandwich, che mostra le fasi del test, numerate in ordine 1-4.
Poi viene aggiunto il campione (ad esempio urina, siero o surnatante cellulare). Qualsiasi antigene trovato nel campione si legherà all’anticorpo di cattura che già riveste la piastra. I campioni vengono solitamente aggiunti in duplicato o in triplicato (per consentire l’analisi statistica), e in concentrazioni variabili per garantire che rientri nei livelli di rilevazione del test. Anche in questo caso qualsiasi campione in eccesso viene lavato dalla piastra.
Nella fase 3, viene aggiunto l’anticorpo di rilevamento. Questo anticorpo è etichettato con un enzima, di solito perossidasi di rafano o fosfatasi alcalina. L’anticorpo di rivelazione si lega a qualsiasi antigene target già legato alla piastra. Infine, un substrato viene aggiunto alla piastra. I saggi ELISA sono di solito cromogenici utilizzando una reazione che converte il substrato (ad esempio TMB o ABTS) in un prodotto colorato che può essere misurato utilizzando un lettore di piastre.
La determinazione della concentrazione di antigene in un campione richiede la produzione di una curva standard utilizzando antigeni di una concentrazione nota (mostrata nella Figura 2). La concentrazione di antigene in un campione può quindi essere calcolata utilizzando la densità ottica (OD).
Figura 2. Una tipica curva standard. Viene mostrata una curva standard per un IFN-γ ELISA. Per calcolare la concentrazione di antigene in un campione, è necessario preparare una curva standard utilizzando una soluzione di concentrazione nota.