PMC

Restrikčně-modifikační

Restrikčně-modifikační (RM) systémy se vyskytují všudypřítomně v prokaryotické říši, kde slouží jako obranné systémy proti cizí DNA. V současné době je známo 47 systémů typu I, 3320 systémů typu II a osm systémů typu III. R. Roberts (Beverly, MA) upozornil, že donedávna byly restrikční enzymy identifikovány získáváním bakterií ze sbírek kultur a vzorků z prostředí a jejich analýzou na restrikční aktivitu. Nyní je možné provádět screening nových sekvencí DNA na geny pro DNA metyltransferázy (MTázy), které lze identifikovat podle jejich konzervovaných motivů, a následně hledat asociované geny. Ty jsou dobrými kandidáty na geny restrikčních endonukleáz, protože geny metyltransferáz DNA a restrikčních endonukleáz jsou často propojeny. Nedávné genomové projekty tímto způsobem identifikovaly nečekaně velký počet domnělých RM systémů. Například v genomu Helicobacter pylori bylo identifikováno 25 různých genů MTáz a některé z nich byly spojeny s geny restrikčních enzymů. Screening databází se proto může stát velmi produktivní metodou hledání restrikčních enzymů s novými specifiky. A. Piekarowicz (Varšava, Polsko) referoval o jednom příkladu takového přístupu, který vedl k identifikaci nového restrikčního enzymu typu IC, NgoAXVI.

Restrikční enzymy typu I a III, stejně jako metyl-dependentní enzym McrBC, vyžadují dvě rozpoznávací místa a pro štěpení DNA jsou závislé na hydrolýze ATP (McrBC: GTP) (přehled v Rao et al., 2000). Ke štěpení dochází, když se dva takové enzymy srazí při přenosu DNA, což vysvětluje požadavek na dvě místa (obrázek (obr. 2).2). T. Bickle (Basilej, Švýcarsko) prokázal, že enzymy typu I a McrBC mohou být také stimulovány ke štěpení DNA, když narazí na nespecifický blok. Enzymy typu III jsou naopak takovými bloky inhibovány, protože každý translokační enzym štěpí pouze jedno vlákno a ke štěpení obou vláken DNA potřebuje spolupráci jiného enzymu.

Obr. 2. Enzymy typu III jsou inhibovány takovými bloky. Model aktivace restrikčních enzymů, které pro štěpení DNA vyžadují ATP (nebo GTP). Po navázání dvou molekul enzymů (nebo komplexů) na dvě rozpoznávací místa na lineární molekule DNA se DNA přemístí v aktivním, energeticky závislém procesu, který vyžaduje ATP nebo GTP v závislosti na systému. Tímto způsobem se DNA zacyklí. Ke štěpení dochází po srážce dvou přemísťujících se komplexů, a to na náhodných místech v blízkosti rozpoznávacích míst (enzymy typu III a McrBC) nebo dále od nich (enzymy typu I).

Ačkoli většina restrikčních enzymů typu II jsou homodimery, které interagují s jednou kopií svého palindromického rozpoznávacího místa, existují podtypy, které vyžadují spolupráci dvou míst (přehled v Pingoud a Jeltsch, 1997). Jak upozornil S. Halford (Bristol, UK), je tomu tak nejen u enzymů typu IIe, jako je NaeI, ale také u enzymů typu IIf, jako je SfiI, a enzymů typu IIS, jako je FokI. Enzymy typu IIf jsou homotetramery se dvěma oddělenými vazebnými místy pro DNA, z nichž každé je tvořeno dvěma podjednotkami. SfiI je aktivní pouze tehdy, když jsou obsazena obě vazebná místa DNA, což vede k současnému štěpení obou míst. U FokI, který se skládá ze štěpné a rozpoznávací domény, bylo již dříve prokázáno, že ke štěpení je nutná dimerizace enzymu na DNA. Halford nyní ukázal, že pro účinné štěpení jsou nutná dvě rozpoznávací místa, protože každá z rozpoznávacích domén musí interagovat s rozpoznávací sekvencí. Všechny tři typy enzymů působí optimálně se dvěma místy na stejné DNA, kde zachytí DNA mezi místy ve smyčce.

Atypické restrikční enzymy typu II jsou nadále objevovány. BbvCI je heterodimerní restrikční enzym, který rozpoznává asymetrickou sekvenci. Podjednotky jsou samostatně neaktivní, ale společně jsou aktivní. To umožňuje vytvořit specifické restrikční enzymy inaktivací jedné podjednotky pomocí mutageneze řízené místem, jak uvedl G. Wilson (Beverly, MA). A. Janulaitis (Vilnius, Litva) získal podobný výsledek pro heterodimerní restrikční enzym Bpu10I. Podařilo se mu také uvolnit substrátovou specifitu Eco57I, monomerního restrikčního a modifikačního enzymu, který má jedinou cílovou rozpoznávací doménu. V této studii byla pomocí náhodné mutageneze vytvořena varianta, která interaguje nejen s kanonickým místem CTGAAG, ale také s místem CTGGAG. Molekulární základ této uvolněné specifity je třeba ještě určit. V. Siksnys (Vilnius, Litva) referoval o objevu nového restrikčního enzymu typu IIs, BfiI, který není při štěpení závislý na iontech dvojmocných kovů. Tento enzym vykazuje sekvenční podobnost s nespecifickou nukleázou ze Salmonella typhimurium a pravděpodobně využívá podobný katalytický mechanismus.

A. Pingoud (Giessen, Německo) se zabýval mechanismem štěpení DNA restrikčními enzymy typu II a naváděcími endonukleázami, které mají společnou funkci, ale obecně mají odlišnou strukturu a pravděpodobně se řídí odlišným mechanismem štěpení. Přestože jsou k dispozici podrobné informace o struktuře mnoha restrikčních enzymů, které mají společný katalytický motiv, neexistuje shoda ohledně katalytického mechanismu ani počtu iontů Mg2+ , které se na katalýze podílejí. V zásadě totéž platí i pro další fosforyltransferázy s katalytickým centrem podobným restrikčním enzymům. Příkladem takových proteinů je opravný enzym Vsr (E. coli) a resolvasa Hjc (Pyrococcus furiosus). Krystalovou strukturu posledně jmenovaného enzymu představil K. Morikawa (Osaka, Japonsko) (obrázek (obr.3).3). Naproti tomu mechanismus štěpení DNA naváděcími endonukleázami z rodiny HNH, například I-PpoI, se zdá být lépe stanoven, protože kromě podrobných biochemických informací pro tento a příbuzné enzymy nadrodiny „ββα-Me finger“ jsou k dispozici strukturní informace pro volný enzym i komplexy enzym-substrát a enzym-produkt. Tyto enzymy vyžadují jako kofaktor ion Mg2+ , který je vázán na konzervovaný Asn. Útočící hydroxylový ion je generován konzervovaným His, stabilizace přechodného stavu zahrnuje konzervovaný Arg a protonace odcházející skupiny je umožněna molekulou vody z hydratační sféry iontu Mg2+.

Bakterie vyvinuly RM systémy pro boj s bakteriofágy. Ty zase vyvinuly různé způsoby, jak uniknout restrikci ze strany bakteriálních RM systémů. D. Dryden (Edinburgh, Velká Británie) uvedl výsledky biochemické analýzy proteinu genu 0.3 z bakteriofága T7, který je inhibitorem restrikčně-modifikačních enzymů I. typu. Tento protein se stechiometricky váže na restrikční enzym a díky své prodloužené formě a zápornému povrchovému náboji pravděpodobně zcela vyplňuje vazebné místo enzymu pro DNA, a tím zabraňuje vazbě DNA.

RM systémy se skládají z restrikčních endonukleáz a DNA metyltransferáz (MTáz) (přehled v Cheng, 1995; Robertson a Wolffe, 2000). Protože však vzor metylace DNA přidává do DNA informaci a tím rozšiřuje její kódovací kapacitu, nejsou MTázy pouze společníky restrikčních enzymů v RM systémech, ale mají mnoho dalších důležitých funkcí. U prokaryot hrají roli při opravách DNA a regulaci genové exprese a replikace DNA. U eukaryot vede metylace DNA obecně k transkripčnímu umlčení genů. Přispívá k epigenetickým procesům, jako je inaktivace chromozomu X, imprinting a regulace genů. S objevem, že několik DNA MTáz je nezbytných pro vývoj myší, se význam metylace DNA stal všeobecně uznávaným.

X. Cheng (Atlanta, GA) představil strukturu proteinu Dnmt2, která by mohla být první strukturou eukaryotické DNA MTázy. Protein má MTázový záhyb a má všechny charakteristické katalytické motivy, ale zdá se, že postrádá jakoukoli katalytickou aktivitu. To vyvolává otázky, například zda se skutečně jedná o enzym a co je vlastně jeho substrátem (DNA, RNA nebo něco jiného). Další diskuse o eukaryotických enzymech, kterou vedli Cheng a A. Jeltsch (Giessen, Německo), se zabývala enzymy Dnmt1, Dnmt3a a Dnmt3b. Oba přednášející referovali o výsledcích získaných se zkrácenými proteiny a izolovanými doménami těchto obrovských enzymů (zahrnujících až 1700 aminokyselinových zbytků) a rovněž prezentovali výsledky týkající se enzymatické analýzy purifikovaných enzymů. Protože katalytická doména Dnmt1 (∼500 aminokyselinových zbytků) není v izolované formě aktivní, musí být pod přísnou kontrolou ostatních částí enzymu. Tato interakce může být nutná k zajištění vysoké specifity pro hemimetylovanou DNA. Navzdory pokroku v této oblasti je proces metylace DNA u eukaryot, zejména mechanismy, které vytvářejí vzor metylace DNA, stále málo známý.

O něco více je známo o metylaci DNA u prokaryot. R. Gumport (Urbana, IL) představil strukturu prokaryotické MTázy M.RsrI, čímž potvrdil domněnku, že katalytické domény všech MTáz mají společnou architekturu. S. Klimasauskas (Vilnius, Litva), D. N. Rao (Bangalore, Indie), Gumport a Jeltsch diskutovali o molekulární enzymologii čtyř prokaryotických MTas (M.HhaI, M.EcoP15, M.RsrI a M.EcoRV). Katalytický cyklus těchto enzymů zahrnuje vazbu DNA a kofaktoru, lokalizaci a rozpoznání cílového místa a konformační změny komplexu včetně převrácení báze a přenosu methylové skupiny (obrázek (Figure4).4). Ukázaly se rozdíly v detailech; např. pořadí vazby substrátu a kofaktoru a krok omezující rychlost se u různých MTáz liší. Ukázalo se, že 2-aminopurin je dobrým nástrojem pro analýzu kinetiky konformačních změn, kterými DNA prochází v komplexu s MTázami, včetně převracení bází.

Obr. 4. Kinetika konformačních změn DNA v komplexu s MTázami. Mechanismus umístění cílového místa restrikčními endonukleázami a DNA metyltransferázami. Nejprve je DNA navázána nespecificky, poté je cílové místo lokalizováno usnadněnou difuzí (klouzáním a přeskakováním) na DNA. Kontakty s cílovými místy vyvolávají konformační změny enzymu a DNA, které následně spouštějí katalýzu. Tento mechanismus je společný pro většinu enzymů, které specificky interagují s DNA.

.