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Restriction-modification

I sistemi RM (Restriction-modification) si trovano in modo ubiquitario nel regno procariota dove servono come sistemi di difesa contro il DNA estraneo. Attualmente sono noti 47 sistemi di tipo I, 3320 di tipo II e otto di tipo III. R. Roberts (Beverly, MA) ha sottolineato che, fino a poco tempo fa, gli enzimi di restrizione erano stati identificati ottenendo batteri da collezioni di colture e campioni ambientali e analizzandoli per l’attività di restrizione. Ora è possibile vagliare nuove sequenze di DNA per i geni di metiltransferasi del DNA (MTasi), che possono essere identificati dai loro motivi conservati, e poi cercare i geni associati. Questi sono buoni candidati per i geni delle endonucleasi di restrizione, perché i geni delle metiltransferasi del DNA e delle endonucleasi di restrizione sono spesso collegati. Recenti progetti sul genoma hanno identificato un numero inaspettatamente grande di sistemi RM putativi in questo modo. Per esempio, 25 diversi geni MTasi sono stati identificati nel genoma di Helicobacter pylori, e alcuni di questi erano associati a geni di enzimi di restrizione. Lo screening dei database può quindi diventare un metodo molto produttivo per trovare enzimi di restrizione con nuove specificità. A. Piekarowicz (Varsavia, Polonia) ha riportato un esempio di tale approccio che ha portato all’identificazione di un nuovo enzima di restrizione di tipo IC, NgoAXVI.

Gli enzimi di restrizione di tipo I e III, così come l’enzima McrBC metil-dipendente, richiedono due siti di riconoscimento e dipendono dall’idrolisi dell’ATP (McrBC: GTP) per la scissione del DNA (rivisto in Rao et al., 2000). La scissione avviene quando due di questi enzimi si scontrano durante la traslocazione del DNA, il che spiega il requisito di due siti (Figura (Figura2).2). T. Bickle (Basilea, Svizzera) ha dimostrato che gli enzimi di tipo I e McrBC possono anche essere stimolati a scindere il DNA quando incontrano un blocco non specifico. Gli enzimi di tipo III, al contrario, sono inibiti da tali blocchi, perché ogni enzima traslocante taglia solo un filamento e richiede la cooperazione di un altro enzima per la scissione di entrambi i filamenti di DNA.

Fig. 2. Modello per l’attivazione degli enzimi di restrizione che richiedono ATP (o GTP) per la scissione del DNA. Dopo il legame di due molecole (o complessi) di enzimi a due siti di riconoscimento su una molecola di DNA lineare, il DNA viene traslocato in un processo attivo e dipendente dall’energia che richiede ATP o GTP, a seconda del sistema. In questo modo, il DNA viene scisso. La scissione avviene dopo la collisione di due complessi traslocatori, in siti casuali nelle vicinanze dei siti di riconoscimento (enzimi di tipo III e McrBC) o più lontani da essi (enzimi di tipo I).

Anche se la maggior parte degli enzimi di restrizione di tipo II sono omodimeri che interagiscono con una copia del loro sito di riconoscimento palindromico, esistono sottotipi che richiedono la cooperazione di due siti (rivisto in Pingoud e Jeltsch, 1997). Come sottolineato da S. Halford (Bristol, UK), questo è il caso non solo degli enzimi di tipo IIe, come NaeI, ma anche degli enzimi di tipo IIf, come SfiI, e degli enzimi di tipo IIS, come FokI. Gli enzimi di tipo IIf sono omotetrameri con due siti di legame al DNA separati, ciascuno formato da due subunità. SfiI è attivo solo quando entrambi i siti di legame al DNA sono occupati, portando a una scissione simultanea di entrambi i siti. Per FokI, che consiste in un dominio di scissione e un dominio di riconoscimento, è stato dimostrato in precedenza che la dimerizzazione dell’enzima sul DNA è necessaria per la scissione. Halford ha ora dimostrato che due siti di riconoscimento sono necessari per una scissione efficiente, perché ciascuno dei domini di riconoscimento deve interagire con una sequenza di riconoscimento. Tutti e tre i tipi di enzimi agiscono in modo ottimale con due siti sullo stesso DNA, dove intrappolano il DNA tra i siti in un loop.

Continuano ad essere scoperti enzimi di restrizione atipici di tipo II. BbvCI è un enzima di restrizione eterodimero che riconosce una sequenza asimmetrica. Le subunità sono inattive individualmente, ma attive insieme. Questo rende possibile creare enzimi di restrizione specifici inattivando una subunità usando la mutagenesi diretta al sito, come è stato riportato da G. Wilson (Beverly, MA). A. Janulaitis (Vilnius, Lituania) ha ottenuto un risultato simile per l’enzima di restrizione eterodimero Bpu10I. Egli è anche riuscito a rilassare la specificità del substrato di Eco57I, un enzima di restrizione e modifica monomerico, che ha un singolo dominio di riconoscimento del bersaglio. In questo studio, la mutagenesi casuale è stata usata per generare una variante che interagisce non solo con il sito CTGAAG canonico, ma anche con i siti CTGGAG. La base molecolare di questa specificità rilassata deve ancora essere determinata. V. Siksnys (Vilnius, Lituania) ha riferito la scoperta di un nuovo enzima di restrizione di tipo IIs, BfiI, che non dipende da ioni metallici divalenti per la scissione. Questo enzima mostra somiglianza di sequenza con una nucleasi non specifica di Salmonella typhimurium e presumibilmente utilizza un meccanismo catalitico simile.

A. Pingoud (Giessen, Germania) ha discusso il meccanismo di scissione del DNA da parte degli enzimi di restrizione di tipo II e delle endonucleasi homing, che condividono una funzione comune, ma in generale hanno strutture diverse e presumibilmente seguono diversi meccanismi di scissione. Nonostante il fatto che informazioni dettagliate sulla struttura siano disponibili per molti enzimi di restrizione che condividono un motivo catalitico comune, non c’è consenso riguardo al meccanismo catalitico o al numero di ioni Mg2+ che sono coinvolti nella catalisi. In linea di principio, lo stesso vale per altre fosforil transferasi con un centro catalitico simile a quello degli enzimi di restrizione. Esempi di tali proteine sono l’enzima di riparazione Vsr (E. coli) e la Hjc resolvase (Pyrococcus furiosus). La struttura cristallina di quest’ultima è stata presentata da K. Morikawa (Osaka, Giappone) (Figura (Figura3).3). Al contrario, il meccanismo di scissione del DNA da parte delle endonucleasi homing della famiglia HNH, per esempio I-PpoI sembra essere meglio stabilito, perché sono disponibili informazioni strutturali per l’enzima libero e per i complessi enzima-substrato ed enzima-prodotto, oltre a informazioni biochimiche dettagliate per questo enzima e per enzimi correlati della superfamiglia ‘ββα-Me finger’. Questi enzimi richiedono uno ione Mg2+ come cofattore che è legato ad un Asn conservato. Lo ione idrossile attaccante è generato da un His conservato, la stabilizzazione dello stato di transizione coinvolge un Arg conservato e la protonazione del gruppo lasciante è permessa da una molecola d’acqua dalla sfera di idratazione dello ione Mg2+.

I batteri hanno sviluppato sistemi RM per combattere i batteriofagi. Questi a loro volta hanno sviluppato vari mezzi per sfuggire alla restrizione dei sistemi RM batterici. D. Dryden (Edimburgo, Regno Unito) ha riportato i risultati di un’analisi biochimica della proteina del gene 0.3 del batteriofago T7, che è un inibitore degli enzimi di restrizione-modificazione di tipo I. Questa proteina si lega stechiometricamente all’enzima di restrizione e, a causa della sua forma allungata e della sua carica superficiale negativa, presumibilmente riempie completamente il sito di legame al DNA dell’enzima e quindi impedisce il legame al DNA.

I sistemi RM consistono di endonucleasi di restrizione e metiltransferasi del DNA (MTasi) (rivisto in Cheng, 1995; Robertson e Wolffe, 2000). Tuttavia, poiché il modello di metilazione del DNA aggiunge informazioni al DNA e quindi estende la sua capacità di codifica, le MTasi non sono solo le compagne degli enzimi di restrizione nei sistemi RM, ma hanno molte altre funzioni vitali. Nei procarioti, svolgono ruoli nella riparazione del DNA e nella regolazione dell’espressione genica e della replicazione del DNA. Negli eucarioti, la metilazione del DNA porta generalmente al silenziamento trascrizionale dei geni. Contribuisce ai processi epigenetici come l’inattivazione del cromosoma X, l’imprinting e la regolazione dei geni. Con la scoperta che diverse DNA MTasi sono essenziali per lo sviluppo nei topi, l’importanza della metilazione del DNA è diventata ampiamente accettata.

X. Cheng (Atlanta, GA) ha presentato la struttura della proteina Dnmt2, che potrebbe essere la prima struttura di una DNA MTasi eucariotica. La proteina ha una piega da MTasi e possiede tutti i motivi catalitici caratteristici, ma sembra essere priva di qualsiasi attività catalitica. Questo solleva domande come se sia effettivamente un enzima e quale sia effettivamente il suo substrato (DNA, RNA o qualcos’altro). Ulteriori discussioni sugli enzimi eucariotici da parte di Cheng e A. Jeltsch (Giessen, Germania) hanno riguardato gli enzimi Dnmt1, Dnmt3a e Dnmt3b. Entrambi i relatori hanno riportato i risultati ottenuti con proteine troncate e domini isolati di questi enormi enzimi (che comprendono fino a 1700 residui aminoacidici), oltre a presentare risultati riguardanti l’analisi enzimatica di enzimi purificati. Poiché il dominio catalitico di Dnmt1 (∼500 residui aminoacidici) non è attivo in forma isolata, deve essere sotto stretto controllo di altre parti dell’enzima. Questa interazione potrebbe essere necessaria per assicurare un’alta specificità per il DNA emimetilato. Nonostante i progressi nel campo, il processo di metilazione del DNA negli eucarioti, in particolare i meccanismi che creano il modello di metilazione del DNA, è ancora poco compreso.

Si sa qualcosa di più sulla metilazione del DNA nei procarioti. R. Gumport (Urbana, IL) ha presentato la struttura della MTasi M.RsrI procariotica, confermando la congettura che i domini catalitici di tutte le MTasi hanno un’architettura comune. S. Klimasauskas (Vilnius, Lituania), D.N. Rao (Bangalore, India), Gumport e Jeltsch hanno discusso l’enzimologia molecolare di quattro MTasi procariotiche (M.HhaI, M.EcoP15, M.RsrI e M.EcoRV). Il ciclo catalitico di questi enzimi coinvolge il legame al DNA e al cofattore, la localizzazione e il riconoscimento del sito bersaglio, e i cambiamenti conformazionali del complesso tra cui il flipping delle basi e il trasferimento del gruppo metile (Figura (Figura4).4). Le differenze nei dettagli sono diventate evidenti; per esempio, l’ordine del legame del substrato e del cofattore e il passo limitante della velocità differisce nelle varie MTasi. La 2-aminopurina si è dimostrata un buon strumento per analizzare la cinetica dei cambiamenti conformazionali che il DNA subisce in complesso con le MTasi, incluso il flipping delle basi.

Fig. 4. Meccanismo di localizzazione del sito bersaglio da parte delle endonucleasi di restrizione e delle metiltransferasi del DNA. Prima il DNA è legato in modo non specifico, poi il sito bersaglio è localizzato per diffusione facilitata (sliding e hopping) sul DNA. I contatti con i siti bersaglio inducono cambiamenti conformazionali dell’enzima e del DNA che a loro volta innescano la catalisi. Questo meccanismo è comune alla maggior parte degli enzimi che interagiscono specificamente con il DNA.