Rozlišení divočáka a prasete domácího v potravinách pomocí zaměření dvou genových lokusů pomocí PCR v reálném čase

Návrh primerů a sond

Pro návrh primerů a sond jsme vybrali polymorfismy, které již byly popsány a umožňují rozlišení divočáka a prasete domácího. Začali jsme SNP g.299084751 C > T v genu NR6A1, u kterého byla zjištěna souvislost s počtem hrudních a bederních obratlů: divoká prasata, která jsou homozygotní pro alelu g.299084751 C, mají 19 obratlů, zatímco domácí prasata, která jsou homozygotní pro g.299084751 T, mají 21-23 obratlů. Ve studii Fontanesiho a kol. byl tento SNP použit k rozlišení divokých prasat a prasat domácích pomocí PCR-RFLP10. Naším cílem bylo navrhnout jeden pár primerů pro amplifikaci cílové oblasti jak u prasete divokého, tak u prasete domácího, a dvě TaqMan sondy, specifické pro alelu prasete divokého (g.299084751 C), resp. prasete domácího (g.299084751 T). Duplexní test by měl umožnit současnou detekci divokého prasete a domácího prasete v jedné a téže jamce. Celkem jsme navrhli čtyři dopředné primery, tři reverzní primery, čtyři sondy pro divoká prasata a jednu sondu pro prase domácí a zkombinovali je do 21 systémů primerů/sond (Chr1a – u, doplňková tabulka 1). Systém primerů/sond Chr1a byl zaměřen na horní vlákno, systémy primerů/sond Chr1b-u na dolní vlákno genu NR6A1. V sérii experimentů jsme zjišťovali, zda jsou systémy primer/sonda specifické pro divoká prasata nebo zda vykazují zkříženou reaktivitu s domácími plemeny/kříženci prasat. Systém primer/sonda Chr1a vedl k hodnotě ΔCt ≥ 10,56 mezi prasetem domácím a divokým (doplňková tabulka 2). U systémů primer/sonda Chr1i – o se hodnoty ΔCt pohybovaly v rozmezí od 8,65 do 11,19. Systémy primerů/sond Chr1b – h a Chr1p – t nevedly ke zvýšení fluorescenčního signálu u plemen/kříženců prasat domácích. Jelikož systém primer/sonda Chr1q vedl k nejnižší hodnotě Ct (24,77; n = 2) pro divoká prasata, testovali jsme jeho použitelnost v kombinaci se sondou TaqMan pro prase domácí ve formátu duplexního testu (systém primer/sonda Chr1u, doplňková tabulka 1). Vzhledem k tomu, že hodnoty Ct pro prase divoké (26,21, n = 2) i prase domácí (27,90, n = 2) byly uspokojivé, byly všechny další experimenty PCR zaměřené na SNP g.299084751 C > T provedeny s primer/probe systémem Chr1u. V dalším textu se duplexní test PCR v reálném čase nazývá assayChr1 a skládá se z testu pro prase domácí, assayChr1D, zahrnujícího dopředný primer Chr1f4, reverzní primer Chr1r2 a sondu Chr1p1D, a z testu pro divoká prasata, assayChr1W, zahrnujícího dopředný primer Chr1f4, reverzní primer Chr1r2 a sondu Chr1p4W (obr. 1). 1A).

Částečné sekvence (A) genu NR6A1 na chromozomu 1 nesoucího SNP g.299084751. C > T, na který se zaměřuje duplexní test „assayChr1“, a (B) chromozomu 9 nesoucího SNP g.118314929 A > G (rs81416363), na který se zaměřují dva singleplexové testy „assayChr9D“ a „assayChr9W“. Šipky označují pozice primerů (tmavě šedá) a sond (světle šedá). (A) Duplexní zkouška assayChr1 zahrnovala dopředný primer Chr1f4, reverzní primer Chr1r2, sondu Chr1p4W a sondu Chr1p1D. (B) Singleplexový testChr9D zahrnoval forward primer Chr9f8, reverzní primer Chr9r17D a sondu Chr9p2; singleplexový testChr9W zahrnoval forward primer Chr9f8, reverzní primer Chr9r12W a sondu Chr9p2. Poddruhově specifické báze jsou znázorněny tučně (svislé červené šipky) a neshodné báze modře (svislé modré šipky).

Protože jsme se z literatury dozvěděli, že diskriminační síla při zaměření pouze na jeden polymorfismus s největší pravděpodobností není dostatečná, hledali jsme další vhodný genový lokus. Při zkoumání 20 SNP z hlediska jejich použitelnosti k rozlišení mezi divokým prasetem a prasetem domácím Beugin a kol. zjistili, že nejvyšší diskriminační sílu vykazují SNP rs80864596 (intergenní, chromozom 5), rs80796712 (glykogen syntáza kináza 3-beta, chromozom 13) a rs81416363 (intergenní, chromozom 9)11. Proto jsme tyto tři SNP vybrali pro návrh systémů primerů/sond. Ve srovnání s návrhem primerů/sond pro SNP g.299084751 C > T jsme sledovali odlišnou strategii. Místo umístění poddruhově specifické báze v sondě jsme ji umístili na předposlední místo od 5′ konce přímého nebo reverzního primeru. Abychom zvýšili specifičnost, zavedli jsme záměrné neshody bází. Tato takzvaná technika amplifikačního mutačního testu (mismatch amplification mutation assay – MAMA)12,13 má tu výhodu, že je poměrně úsporná, protože jednu a tutéž sondu lze testovat s několika primery lišícími se polohou neshody. V první sérii pokusů jsme zavedli neshodnou bázi buď na 3., nebo na 6. pozici od 3′ konce primeru nesoucího poddruhově specifickou bázi. Když jsme vyvíjeli PCR testy v reálném čase pro jeleny lesní, daňky a jeleny sika14,15,16 , ukázala se tato strategie jako úspěšná. V této studii však žádný ze systémů primer/sonda (Chr5b – d, Chr13b – c, Chr9b – g, Chr9i – n, doplňková tabulka 1) neumožnil rozlišit prase domácí a prase divoké (doplňková tabulka 3). Nejlepších výsledků (hodnota ΔCt mezi plemeny/kříženci prasat domácích a divokých prasat ≥5,24) bylo dosaženo se systémem primerů/sond Chr9j. V tomto systému primer/sonda, zaměřeném na SNP rs81416363 na chromozomu 9, se neshodná báze nacházela na 3. pozici od 3′ konce primeru (TTCACG → TTCCCG). Pro zvýšení specifity jsme zavedli další neshodu ve 4. (TTCACG → TTGCCG, TTACCG, TTTCCG) nebo 5. pozici (TTCACG → TACCCG, TCCCCG, TGCCCG) od 3′ konce primeru. Zavedení dalších neshod se ukázalo jako úspěšné. Pomocí systému primer/sonda Chr9r (Doplňková tabulka 1) jsme získali jak nejnižší hodnotu Ct pro divoká prasata (22,09; n = 2), tak nejvyšší hodnotu ΔCt (10,52) mezi domácími plemeny/kříženci prasat a divokými prasaty (Doplňková tabulka 3). Tento test PCR v reálném čase pro divoká prasata, zaměřený na SNP rs81416363 nacházející se na chromozomu 9, byl založen na systému primerů/sond Chr9r (Chr9f8, Chr9r12W, Chr9p2).

Dále jsme použili strategii MAMA k vývoji odpovídajícího testu PCR v reálném čase, zaměřeného na SNP rs81416363 nacházející se na chromozomu 9, pro prase domácí. Specifickou bázi pro prase domácí jsme umístili na předposlední bázi od 5′ konce primeru a chybnou bázi na 3. pozici od 3′ konce (systémy primer/sonda Chr9v – x; doplňková tabulka 1). Zavedení jedné neshodující se báze však nestačilo k rozlišení prasete domácího a prasete divokého. Zavedení neshodných bází na 3. a 5. pozici od 3′ konce primeru (systémy primer/sonda Chr9y – ag) vedlo k hodnotě ΔCt ≥ 4,83. Pokud se neshody nacházely na 3. a 4. pozici (systémy primer/probe Chr9ah – aj), hodnota ΔCt byla ≥ 5,85. Zavedením tří po sobě jdoucích neshodných bází vedle poddruhově specifické báze (systémy primer/sonda Chr9ak – am) bylo možné zvýšit specifitu. Systém primer/sonda Chr9ak, v němž se neshody nacházely na pozicích 3, 4 a 5 (TTCATG → TGGTTG), vedl k nejvyšší hodnotě ΔCt ≥9,97. Proto byly všechny další experimenty prováděny se systémem primer/sonda Chr9ak. V dalším textu jsou dva singleplexové testy zaměřené na SNP rs81416363 na chromozomu 9 označovány jako assayChr9D, zahrnující forward primer Chr9f8, reverse primer Chr9r17D a sondu Chr9p2, a assayChr9W, zahrnující forward primer Chr9f8, reverse primer Chr9r12W a sondu Chr9p2 (obr. 1B).

Optimalizace koncentrace primeru/sondy a poměru

Všechny výše uvedené výsledky byly získány při koncentracích primeru a sondy 500 nM a 200 nM (systémy primer/sonda zaměřené na chromozom 1), resp. 200 nM a 100 nM (systémy primer/sonda zaměřené na chromozomy 5, 9 a 13). Dále jsme zkoumali, zda lze zvýšit specifičnost testů PCR v reálném čase optimalizací koncentrace a poměru primerů a sond. V případě testuChr1 bylo zjištěno, že optimální koncentrace primeru a sondy je 1 000 nM a 200 nM (doplňková tabulka 4). V případě assayChr9W a assayChr9D vedl přebytek primeru nesoucího jak poddruhově specifickou bázi, tak neshodnou bázi k vyšším hodnotám ΔCt mezi křížově reagujícím poddruhem a cílovým druhem. Nejvyšší selektivity testů assayChr9W a assayChr9D bylo dosaženo při koncentracích přímého primeru/reverzního primeru/sondy 12,5/200/50 nM, resp. 62,5/800/50 nM.

Testy křížové reaktivity

Dále jsme provedli testy křížové reaktivity s izoláty DNA z divokých prasat, různých plemen/kříženců domácích prasat a dalších 22 druhů zvířat uvedených v doplňkové tabulce 5. V tabulce 5 jsou uvedeny výsledky testů křížové reaktivity. Obrázky 2A-D ukazují amplifikační křivky získané pomocí assayChr9W, assayChr9D, assayChr1W a assayChr1D. AssayChr9W vykazuje mírnou křížovou reaktivitu s prasaty domácími, jelenem sika, kozorožcem alpským, ovcí, kozou a kamzíkem (ΔCt ≥ 12,10, n = 2), assayChr9D s divokými prasaty, jelenem sika, losem, koněm a krocanem (ΔCt ≥ 8,41, n = 4). Na rozdíl od testů zaměřených na SNP rs81416363 na chromozomu 9 nevykazoval test assayChr1 žádnou zkříženou reaktivitu (s výjimkou testu assayChr1W pro srnčí zvěř pouze v jednom ze čtyř opakování). Analyzovali jsme také izoláty DNA z 50 druhů rostlin běžně používaných jako složky potravin (doplňková tabulka 6). U žádného z testů nebyla zjištěna zkřížená reaktivita s žádným z rostlinných druhů.

Výsledky získané provedením testů zkřížené reaktivity s izoláty DNA (10 ng/µl) od 22 druhů zvířat a prasete divokého/domácího. (A) testChr9W, (B) testChr9D, (C) testChr1W a (D) testChr1D.

Screening různých komerčních master mixů z hlediska jejich použitelnosti

V další sérii experimentů jsme zkoumali, zda typ komerčního master mixu ovlivňuje selektivitu testů. Analyzovali jsme izoláty DNA od 23 druhů zvířat včetně 3 jedinců divokých prasat a 11 plemen/kříženců prasat domácích s celkem pěti mastermixy od různých dodavatelů. Hlavní směsi a příslušné teplotní programy jsou uvedeny v doplňkové tabulce 7. Typ master mixu obecně ovlivnil jak absolutní hodnoty Ct, tak hodnoty ΔCt mezi cílovými a křížově reagujícími (pod)druhy. Testy PCR v reálném čase však byly ovlivněny v různé míře. Například v případě testuChr9W vedly směsi 2 a 3 k vyšším hodnotám Ct než master mix 1 (standardní master mix v této studii), 4 a 5 (Ct ± SD (n = 6): mix 1: 25,03 ± 0,15; mix 2: 31,17 ± 1,70; mix 3: 28,43 ± 0,13; mix 4: 26,64 ± 0,10; mix 5: 26,64 ± 0,17). V případě testuChr9D měl typ master mixu vliv na hodnoty ΔCt, a tedy na selektivitu testu. Hodnoty ΔCt získané s master mixem 1, 2, 3 a 4 byly ≥ 8,41, ≥ 10,40, ≥ 7,18 a ≥ 5,86, zatímco s master mixem 5 nebyla pozorována vůbec žádná křížová reaktivita. V případě testuChr1 byly s master mixem 1, 3 a 4 získány poměrně podobné hodnoty Ct. U master mixu 2 a 5 však nedošlo ke vzniku žádných produktů, pravděpodobně proto, že tyto směsi nejsou vhodné pro multiplexování. Na základě těchto zjištění důrazně doporučujeme otestovat použitelnost, pokud se má použít jiný typ master mixu.

Robustnost

Robustnost testů PCR v reálném čase byla zkoumána změnou teploty žíhání ±1 °C a objemu reakční směsi na jamku o ±5 % a použitím dvou různých cyklérů PCR v reálném čase. Pokusy byly provedeny s izoláty DNA z prasete divokého, prasete domácího a srnce obecného. U testů assayChr9W a assayChr9D byly hodnoty Ct velmi podobné hodnotám získaným za standardních podmínek (hodnoty ΔCt <1,00) s výjimkou případů, kdy byla teplota žíhání zvýšena na 61 °C (hodnoty ΔCt ≤2,16 a ≤1,57). S hodnotami ΔCt ≤0,77 se assayChr1 ukázal být ještě robustnější. Ani snížení celkového objemu reakce, ani použití jiného cyklovače PCR v reálném čase nemělo podstatný vliv na hodnoty Ct, což dokazuje robustnost testů PCR v reálném čase.

Pracovní rozsah, lineární rozsah a účinnost amplifikace

Při analýze izolátu DNA divokých prasat (211 µg/ml) a dvou izolátů DNA domácích prasat (158 µg/ml a 160 µg/ml) sériově ředěných ve vodě (1:2-1:524,288) byly testy assayChr9W, assayChr9D, assayChr1W a assayChr1D lineární mezi 211 µg/ml a 13 ng/ml (R2 = 0.9948), 158 µg/ml a 10 ng/ml (R2 = 0,9981), 211 µg/ml a 6 ng/ml (R2 = 0,9994) a 160 µg/ml a 10 ng/ml (R2 = 0,9988) (obr. 3A). Účinnost amplifikace vypočtená ze sklonů standardních křivek byla 83 %, 96 %, 93 % a 95 %. Kromě toho byl rozsah linearity hodnocen analýzou izolátů DNA divokých prasat a prasat domácích sériově ředěných v DNA spermií sleďů. U testů assayChr9W a assayChr9D se linearita pohybovala od 20 µg/ml do 20 ng/ml (R2 = 0,9988), resp. od 20 µg/ml do 39 ng/ml (R2 = 0,9985) (obr. 3B). V případě testuChr1W a testuChr1D byla linearita v rozsahu od 20 µg/ml do 5 ng/ml (R2 = 0,9978), resp. od 20 µg/ml do 10 ng/ml (R2 = 0,9988). Účinnost amplifikace vypočtená ze sklonů standardních křivek byla 76 %, 90 %, 97 % a 101 %.

Rozsah linearity čtyř testů, (A) stanovený ve vodě jako pozadí a (B) stanovený v DNA spermií sledě jako necílové DNA pozadí.

Tyto výsledky ukazují, že pracovní rozsah testů PCR v reálném čase je téměř totožný, zatímco rozsah linearity je užší pro testy zaměřené na chromozom 9 než pro testy zaměřené na chromozom 1. Všechny amplifikační účinnosti se pohybovaly mezi 90 % a 110 %, jak doporučují pokyny ENGL17 , s výjimkou testuChr9W (83 % ve vodě, 76 % v DNA spermií sleďů). Nižší účinnost amplifikace testuChr9W je pravděpodobně způsobena sníženou stabilitou vazby primeru v důsledku neshod, zavedených za účelem zvýšení selektivity pro cílový živočišný druh.

Mezní hodnota detekce (LOD) v DNA spermií sleďů a DNA prasat jako DNA pozadí

LOD byla definována jako nejnižší koncentrace DNA, která vedla ke zvýšení fluorescenčního signálu alespoň v 19 z 20 opakování. Kromě toho by hodnota Ct měla být nižší než hodnota Ct získaná pro zkříženě reagující druhy.

U DNA spermií sleďů byla LOD testuChr9D (1,0 %, w/w, obr. 4A) byla mírně vyšší než LOD ostatních tří testů (0,2 %, w/w, obr. 4B-D). Vyšší LOD testuChr9D je způsobena zkříženou reaktivitou s divokými prasaty (hodnota ΔCt mezi divokými prasaty a prasetem domácím pouze ≥8,41).

Stanovení LOD analýzou sériových ředění (A-D) směsi DNA obsahující DNA prasete divokého nebo prasete domácího v DNA spermií sledě a (E-H) směsi DNA obsahující DNA prasete divokého v DNA prasete domácího nebo DNA prasete domácího v DNA prasete divokého jako DNA pozadí. (A,E) byly získány pomocí assayChr9D, (B,F) pomocí assayChr9W, (C,G) pomocí assayChr1D a (D,H) pomocí assayChr1W. Měření byla provedena ve 20 opakováních. Kroužky představují jednotlivé hodnoty Ct, vodorovné čáry označují průměrné hodnoty.

Kromě toho jsme stanovili LOD testů PCR v reálném čase pro prase divoké, assayChr1W a assayChr9W, v DNA prasete domácího jako pozadí, a testů pro prase domácí, assayChr1D a assayChr9D, v DNA prasete divokého jako pozadí. Při použití 2 %, 0,2 %, 5 % a 2 % (w/w) se LOD testů assayChr9D (obr. 4E), assayChr9W (obr. 4F), assayChr1D (obr. 4G) a assayChr1W (obr. 4H) dosti lišily. Vyšší LOD testuChr1D v přítomnosti DNA divokých prasat byla způsobena potlačením signálu, pravděpodobně v důsledku konkurence obou sond o cílovou sekvenci ve formátu duplexního testu. Za účelem podrobnějšího zkoumání potlačení signálu byly kromě pozitivních kontrol (DNA divokých prasat a DNA domácích prasat) analyzovány směsi DNA obsahující buď 25 % (w/w) DNA divokých prasat v DNA domácích prasat, nebo 25 % (w/w) DNA domácích prasat v DNA divokých prasat.

Při porovnání pozitivních kontrol se standardy zředěnými v poměru 1:4 obsahujícími necílovou DNA jsme nezjistili rozdíl v amplifikačních křivkách (hodnoty ΔRn) pro testChr9W a testChr9D (obr. 5A,B). V případě testů assayChr1W a assayChr1D však byly fluorescenční signály (hodnoty ΔRn) získané pro pozitivní kontrolu vyšší než signály získané pro standard ředěný v poměru 1:4 při stejné koncentraci cílové DNA (obr. 5C,D).

Křivky amplifikace (v polopřehledu) získané pro směsi DNA (20 ng/µl) obsahující 25 % (hm.) cílového poddruhu (prase divoké nebo prase domácí) a 75 % (hm.) necílového poddruhu (prase divoké nebo prase domácí) a jejich sériová ředění (1:4 až 1:1024). Jako kontroly byly použity izoláty DNA (5 ng/µl) z prasete divokého a prasete domácího. TestChr9W (A) a testChr9D (B) vykazují zkříženou reaktivitu s necílovým poddruhem. AssayChr1W (C) a assayChr1D (D) vykazují potlačení signálu v přítomnosti necílového poddruhu.

Pakovatelnost

Pakovatelnost testů PCR v reálném čase byla zkoumána analýzou směsí masných extraktů obsahujících 30 % (w/w) cílové DNA a 70 % (w/w) DNA necílového poddruhu, jakož i jejich sériových ředění, a to pětkrát ve čtyřech různých dnech. RSD hodnot Ct byla ≤1,0 % (testChr1W), ≤1,9 % (testChr9W), ≤2,3 % (testChr1D) a ≤3,5 % (testChr9D), což dokazuje vysokou opakovatelnost testů.

Analýza vzorků od jedinců prasete divokého a prasete domácího

Při analýze vzorků od 64 jedinců prasete domácího, včetně 14 plemen a 6 kříženců, byly použity testy PCR v reálném čase (obr. 6A). Kromě toho jsme analyzovali celkem 30 vzorků divokých prasat z 5 různých zemí (Rakousko, Estonsko, Německo, Rumunsko a USA, obr. 6B). U jednoho jedince divočáka z Evropy nebyl přesný původ znám. Každý vzorek byl analyzován nejméně ve čtyřech opakováních. Ke každé destičce PCR byla přidána pozitivní kontrola (směs DNA, 10 ng/µl) obsahující cílový poddruh ve stejné koncentraci jako LOD, která poskytovala mezní hodnotu Ct.

Výsledky získané pro (A) 64 vzorků prasete domácího a (B) 30 vzorků prasete divokého. Měření byla provedena nejméně ve čtyřech opakováních.

Při analýze pozitivních kontrol ve 14 opakováních byl průměr ± SD hodnot Ct 33,85 ± 0,93 (assayChr9W), 35,19 ± 1,11 (assayChr9D), 32,89 ± 0,28 (assayChr1W) a 32,60 ± 0,47 (assayChr1D). S výjimkou zkouškyChr9D byly všechny vzorky, u nichž byly zjištěny vyšší hodnoty Ct, považovány za <LOD. V případě testuChr9D bylo u několika vzorků divokých prasat dosaženo hodnot Ct ≥ 34,61. Abychom snížili pravděpodobnost falešně pozitivních výsledků, stanovili jsme mezní hodnotu Ct testu assayChr9D na 34,00. Pro použití assayChr9W a assayChr9D v rutinní analýze doporučujeme použít pozitivní kontrolu sestávající z 2 % (w/w) DNA domácích prasat, 0,2 % (w/w) DNA divokých prasat a 97,8 % (w/w) DNA spermií sleďů.

Při analýze vzorků domácích prasat pomocí assayChr9D jsme získali 63 pozitivních a pouze jeden negativní výsledek (Mangalica 1) (obr. 6). Od 12 jedinců plemene Cinta Senese jsme analyzovali dvě různé části masa, libový vzorek (z longissimus dorsi) a vzorek podkožního hřbetního tuku (z hřbetu) (údaje nejsou uvedeny). Hodnoty Ct získané pro libové vzorky (průměrná Ct ± SD 25,24 ± 0,44, n = 48) byly velmi podobné hodnotám pro vzorky podkožního hřbetního tuku (26,29 ± 0,35, n = 48). Při analýze 30 vzorků divokých prasat pomocí assayChr9D se u 21 vzorků nezvýšil fluorescenční signál, ale devět jedinců (jeden z Rakouska, pět z Německa a tři z USA) bylo identifikováno jako prase domácí.

Při použití assayChr9W byla většina vzorků divokých prasat přiřazena správně, pouze u tří vzorků (jeden z Německa a dva z USA) jsme získali negativní výsledky. AssayChr9W však vedl k pozitivním výsledkům i u některých jedinců prasete domácího, včetně jednoho kusu bentheimského černostrakatého, tří kusů krškopolského a tří kusů prasete mangalického. Pozoruhodné je, že tři prasata plemene Mangalica z Rakouska byla identifikována jako prase domácí, zatímco tři jedinci z Německa byli identifikováni jako divoká prasata. V případě testuChr9, včetně testuChr9W a testuChr9D, vedlo 12 z 94 vzorků masa k nejednoznačným výsledkům, protože u obou testů PCR v reálném čase bylo dosaženo zvýšení fluorescenčního signálu. Kromě toho byl jeden jedinec prasete mangalického identifikován jako divoké prase a tři jedinci divokého prasete jako prase domácí.

Ve studii Beugin et al.11 byla vhodnost SNP rs81416363 testována na „čistých“ divokých prasatech lovených v přírodním parku ve Vogézách ve Francii a na omezeném počtu komerčních plemen prasat (landrace, velké bílé, piétrain a duroc). Bylo zjištěno, že divočáci nesou alelu G (frekvence 100 %, žádná heterozygotnost), domácí prasata alelu A (frekvence 98 %, heterozygotnost 5 %).

Abychom zjistili, proč testy assayChr9W a assayChr9D vedly k několika chybným klasifikacím a některým nejednoznačným výsledkům, genotypizovali jsme příslušné vzorky divočáků a domácích prasat pomocí analýzy tání s vysokým rozlišením (HRM). Analýzu HRM jsme použili, protože se jedná o výkonnou, časově a finančně nenáročnou techniku pro genotypování SNP18. Normalizované křivky tání (obr. 7A) ukazují, že homozygotní genotyp G byl nalezen nejen u vzorků divokých prasat, ale také u vzorku Mangalica (vzorek 1), u kterého bylo dosaženo zvýšení fluorescenčního signálu pomocí assayChr9W, ale ne pomocí assayChr9D. Bylo zjištěno, že vzorky divokých prasat, u kterých bylo dosaženo zvýšení fluorescenčního signálu pomocí assayChr9D, nesou alespoň jednu kopii alely A. Čtyři jedinci divokých prasat vykazovali heterozygotní genotyp, pět bylo homozygotních pro alelu A. Kromě toho bylo zjištěno, že pět jedinců prasete domácího, včetně tří jedinců Krškopolje ze Slovinska, nese jak alelu A, tak alelu G. Genotypizací HRM jsme tedy mohli ověřit, že výsledky získané pomocí assayChr9W a assayChr9D odpovídají příslušným genotypům jedinců. Naše výsledky však naznačují, že dva singleplexové testy zaměřené na SNP rs81416363, assayChr9W a assayChr9D, neumožňují jednoznačné rozlišení prasete divokého a domácího.

Normalizované křivky HRM pro (A) SNP rs81614363 (g.118314929 A > G) na chromozomu 9 pro homozygota G (prase divoké), homozygota A (prase domácí) a heterozygota A + G a (B) SNP g.299084751 C > T na chromozomu 1 pro homozygota C (prase divoké), homozygota T (prase domácí) a heterozygota C + T.

Pomocí testuChr1D byly všechny vzorky prasete domácího kromě tří klasifikovány jako prase domácí (obr. 6). Podle assayChr9D byly hodnoty Ct získané pro vzorky libového a podkožního hřbetního tuku od 12 jedinců plemene Cinta Senese velmi podobné (průměrné Ct ± SD 25,99 ± 0,25 (n = 48) a 26,36 ± 0,25 (n = 48)). Pomocí testuChr1D však bylo také pět z 30 vzorků divokých prasat identifikováno jako prase domácí. Analýza vzorků divokých prasat pomocí assayChr1W vedla pouze k jednomu negativnímu výsledku. Nicméně také jeden vzorek z Mangalice a šest jedinců z Turopolje vedlo při použití assayChr1W ke zvýšení fluorescenčního signálu.

Ve studii Fontanesiho a spol.10 vedl SNP g.299084751 C > T byl genotypizován analýzou vzorků 293 domácích prasat pěti komerčních plemen (italské velké bílé, italská landrace, italský duroc, belgická landrace a piétrain) a 201 divočáků z jižní části střední Evropy (severní Itálie) a jihovýchodní Evropy (Slovinsko a západní Balkán). Fontanesi et al. zjistili, že všichni jedinci prasete domácího jsou homozygotní pro alelu T. Alespoň jednu kopii alely T neslo 7,5 % jedinců divokých prasat, přičemž jedinci z jihovýchodní Evropy nesli alelu T častěji (12,2 %) než jedinci z jihu střední Evropy (3,6 %). U 11,1 % divokých prasat z jihovýchodní Evropy byl zjištěn heterozygotní genotyp C/T.

Při genotypizaci jedinců divokých prasat a domácích prasat pro SNP g.299084751 C > T pomocí HRM analýzy jsme rovněž zjistili alelu T nejen u domácích prasat, ale i u některých divokých prasat (obr. 7B). Jedinec prasete divokého z USA vykazoval homozygotní genotyp T, zatímco jedinec prasete divokého z Dolního Rakouska nesl jak alelu C, tak alelu T. V případě prasete divokého z Dolního Rakouska byl genotyp T homozygotní. Většina jedinců divokých prasat však byla homozygotní pro alelu C. Tento výsledek naznačuje, že zvýšení fluorescenčního signálu u tří vzorků divokých prasat (Německo Bad Kissingen a Perleberg a Evropa) získané pomocí testuChr1D nebylo v souladu s jejich genotypem, a bylo tedy způsobeno zkříženou reaktivitou. Bylo zjištěno, že většina jedinců prasete domácího je homozygotní pro alelu T. U šesti z osmi jedinců Turopolje však byl zjištěn heterozygotní genotyp C/T, což vysvětluje, proč bylo dosaženo zvýšení fluorescenčního signálu jak s assayChr1D, tak s assayChr1W. Vysoká frekvence heterozygotního genotypu C/T u Turopolje, plemene prasat domácích z Chorvatska, je v souladu s velmi nedávnou prací výzkumné skupiny Fontanesi. Genotypizací 47 jedinců plemene Turopolje byla zjištěna frekvence alely T 0,57 a C 0,4319.

Naše výsledky ukazují, že ani dva singleplexové testy zaměřené na SNP rs81416363, ani duplexní test zaměřený na SNP g.299084751 C > T samy o sobě neumožňují jednoznačné rozlišení prasete divokého a domácího. Zohledněním výsledků obou singleplexových testů a duplexního testu však lze diskriminační sílu výrazně zvýšit. Naše výsledky ukazují, že pokud dva testy pro stejný poddruh (např. assayChr9D a assayChr1D) vedou ke shodné klasifikaci (v daném příkladu prase domácí) a výsledky získané dvěma testy pro jiný poddruh (v daném příkladu assayChr9W a assayChr1W) jsou nejednoznačné, je pravděpodobnost chybné klasifikace nízká, pokud se spoléháme na výsledky, které jsou shodné. Podle této strategie bylo možné správně zařadit 86 (91,5 %) z 94 jedinců.

.