Primer and probe design
プライマーとプローブデザインには、既に報告されている多型の中からイノシシと家畜豚を識別可能なものを選択しました。 まず、NR6A1遺伝子のSNP g.299084751 C > Tは、胸椎と腰椎の数に関連することが分かっており、野生型アリルg.299084751 Cをホモ接合で持つイノシシは19椎骨であるが、g.299084751 Tをホモ接合で持つ家豚の脊椎は21-23椎骨であるというものであった。 Fontanesiらの研究では、このSNPを用いてPCR-RFLPによるイノシシと家畜豚の判別が行われた10。 我々は、イノシシと家畜豚の両方で標的領域を増幅するための1つのプライマー対と、イノシシ対立遺伝子（g.299084751 C）と家畜豚対立遺伝子（g.299084751 T）にそれぞれ特異的な2つのTAQMANプローブを設計することを目指した。 この二重アッセイにより、1つの同じウェルでイノシシと家畜豚を同時に検出することが可能になるはずである。 合計で、4つのフォワードプライマー、3つのリバースプライマー、4つのイノシシ用プローブ、1つの家畜用プローブを設計し、それらを組み合わせて21のプライマー/プローブシステム（Chr1a〜u、補足表1）を作成した。 プライマー/プローブシステムChr1aはNR6A1遺伝子の上側鎖を、プライマー/プローブシステムChr1b〜uは下側鎖をターゲットとした。 一連の実験で、プライマー／プローブシステムがイノシシに特異的か、あるいは家畜豚品種／交雑種との交差反応性を示すかどうかを検討した。 プライマー／プローブシステムChr1aは、家畜豚とイノシシとの間でΔCt値≧10.56となった（補足表2）。 プライマー/プローブシステムChr1i – oでは、ΔCt値は8.65から11.19の範囲であった。 プライマー/プローブシステムChr1b – hおよびChr1p – tでは、家畜豚品種/交雑種の蛍光信号の増加は見られなかった。 プライマー／プローブシステムChr1qはイノシシで最も低いCt値（24.77；n＝2）を示したため、家畜豚用のTaqManプローブと組み合わせて二重測定形式で適用性を検証した（プライマー／プローブシステムChr1u、付表1）。 イノシシ（26.21、n = 2）および家畜豚（27.90、n = 2）ともにCt値は満足できるものであったため、以降のSNP g.299084751 C > Tを標的としたPCR実験はすべてprimer/probe system Chr1uで実施された。 以下、二重リアルタイムPCRアッセイをassayChr1と呼び、フォワードプライマーChr1f4、リバースプライマーChr1r2、プローブChr1p1Dからなる家畜豚用アッセイassayChr1DとフォワードプライマーChr1f4、リバースプライマーChr1r2、プローブChr1p4Wからなるイノシシ用アッセイasayChr1Wと呼ぶ (Fig.) 。 1A）。
（A）SNP g.299084751 を有する第1染色体上のNR6A1遺伝子の部分的な配列 C > T（二重測定法 “assayChr1 “の対象）、および（B）SNP g.118314929 A > G（rs81416363）を持つ第9染色体は、2つのシングルプレックスアッセイ “assayChr9D” および “assayChr9W” の対象であった。 矢印は、プライマー（濃い灰色）とプローブ（薄い灰色）の位置を示している。 (A) Duplex assayChr1には、フォワードプライマーChr1f4、リバースプライマーChr1r2、プローブChr1p4W、プローブChr1p1Dが含まれる。 (B）シングルプレックスアッセイChr9DはフォワードプライマーChr9f8、リバースプライマーChr9r17D、プローブChr9p2、シングルプレックスアッセイChr9WはフォワードプライマーChr9f8、リバースプライマーChr9r12W、プローブChr9p2が含まれる。 亜種特異的塩基を太字（赤の縦矢印）、ミスマッチ塩基を青字（青の縦矢印）で示した。
文献から、一つの多型のみを対象とした識別力は十分ではないことがわかったので、さらに適した遺伝子座を探した。 Beuginらは20のSNPについてイノシシと家畜豚の区別への適用性を調べた結果、rs80864596（遺伝子間、第5染色体）、rs80796712（グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β、第13染色体）、rs81416363（遺伝子間、第9染色体）が最も識別力が高いことを発見している11。 そこで、この3つのSNPを選んでプライマー・プローブシステムを設計した。 SNP g.299084751 C > Tのプライマー/プローブ設計とは異なる戦略を追求した。 亜種特異的な塩基をプローブ内に配置するのではなく、フォワードプライマーまたはリバースプライマーの5′末端から2番目の部位に配置したのである。 また、特異性を高めるために、意図的に塩基のミスマッチを導入した。 このミスマッチ増幅突然変異測定法（MAMA）12,13 は、ミスマッチの位置が異なる複数のプライマーで同じプローブをテストできるため、コスト効率が良いという利点がある。 最初の実験では、亜種特異的塩基を導入したプライマーの3末端から3番目か6番目の位置にミスマッチ塩基を導入した。 アカシカ、ノロジカ、ニホンジカについてそれぞれリアルタイムPCR法を開発したとき14,15,16、この戦略は成功した。 しかし、本研究では、いずれのプライマー／プローブ系（Chr5b – d, Chr13b – c, Chr9b – g, Chr9i – n, Supplementary Table 1）でも家畜豚とイノシシの区別ができなかった（Supplementary Table 3）。 プライマー／プローブシステムChr9jで最も良い結果（家畜豚品種／交雑種とイノシシとの間のΔCt値≧5.24）が得られた。 このプライマー・プローブシステムは、9番染色体上のSNP rs81416363を標的とし、ミスマッチ塩基はプライマーの3′末端から3番目の位置（TTCACG → TTCCCG）に配置されたものである。 さらに、特異性を高めるために、プライマーの3末端から4番目（TTCACG → TTGCCG, TTACCG, TTTCCG）または5番目（TTCACG → TACCCG, TCCCCG, TGCCCG）にミスマッチを導入してみた。 さらにミスマッチを導入することで、成功することが判明した。 プライマー／プローブシステムChr9r（補足表1）により、イノシシに対する最低Ct値（22.09；n＝2）および家畜豚品種／交雑種とイノシシとの間の最高ΔCt値（10.52）の両方が得られた（補足表3）。 この9番染色体上のSNP rs81416363を標的としたイノシシ用のリアルタイムPCR法は、プライマー／プローブシステムChr9r（Chr9f8、Chr9r12W、Chr9p2）に基づく。
次に、MAMA戦略を適用して、家畜豚用の、9番染色体上のSNP rs81416363を標的とするリアルタイムPCR法の開発に取り組んだ。 プライマーの5末端から2番目の塩基に家畜豚特異的塩基を、3末端から3番目の位置にミスマッチ塩基を配置した（プライマー・プローブ系 Chr9v – x；補足表1）。 しかし、1つのミスマッチ塩基の導入では、家畜豚とイノシシの鑑別を行うには不十分であった。 プライマーの3末端から3番目と5番目にミスマッチ塩基を導入した場合（プライマー／プローブシステムChr9y〜ag）、ΔCt値≧4.83となった。 ミスマッチが3位と4位の場合（primer/probe systems Chr9ah – aj）、ΔCt値は≥5.85であった。 亜種特異的塩基の隣に連続する3つのミスマッチ塩基を導入することにより（プライマー/プローブシステムChr9ak – am）、特異性を向上させることができた。 3、4、5位にミスマッチがあるプライマー/プローブシステムChr9akでは（TTCATG → TGGTTG）、ΔCt値が最も高く≧9.97となった。 そこで、以降の実験はすべて、プライマー／プローブシステムChr9akを用いて行った。 以下では、第9染色体上のSNP rs81416363を標的とする2つのシングルプレックスアッセイを、フォワードプライマーChr9f8、リバースプライマーChr9r17DおよびプローブChr9p2を含むassayChr9D、ならびにフォワードプライマーChr9f8、リバースプライマーChr9r12WおよびプローブChr9p2（図1B）を含むassayChr9Wと称する（図中）。
プライマーとプローブの濃度と比率の最適化
上記の結果は、プライマーとプローブの濃度をそれぞれ500nMと200nM（1番染色体を対象とするプライマー／プローブシステム）、200nMと100nM（5、9、13番染色体を対象とするプライマー／プローブシステム）で得られたものである。 次に、プライマーとプローブの濃度と比率を最適化することにより、リアルタイムPCRアッセイの特異性を高めることができるかどうかを検討した。 AssayChr1の場合、最適なプライマー濃度とプローブ濃度はそれぞれ1,000 nMと200 nMであることがわかった（Supplement Table 4）。 assayChr9WとassayChr9Dの場合、亜種特異的塩基とミスマッチ塩基の両方を持つプライマーが余ると、交差反応する亜種と標的種の間のΔCt値が高くなることが示された。 assayChr9WとassayChr9Dの最も高い選択性は、フォワードプライマー/リバースプライマー/プローブ濃度がそれぞれ12.5/200/50 nMと62.5/800/50 nMで得られた。
交差反応試験
次に、補足表5に示す野生ブタ、各種家豚品種/交雑種、さらに22種の動物から分離したDNAを用いて交差反応試験を実施した。 図2A〜Dは、それぞれassayChr9W、assayChr9D、assayChr1W、assayChr1Dで得られた増幅曲線である。 assayChr9Wは家畜ブタ、シカ、アルプスアイベックス、ヒツジ、ヤギ、シャモアとわずかに交差反応を示し（ΔCt ≥ 12.10, n = 2）、assayChr9Dはイノシシ、シカ、ムース、ホース、ターキー（ΔCt ≥ 8.41, n = 4）であることがわかった。 9番染色体上のSNP rs81416363を標的としたアッセイとは対照的に、assayChr1は交差反応を示さなかった（ただし、ノロジカのassayChr1Wは4複製中1複製のみであった）。 また、食品原料としてよく使われる50種の植物から分離されたDNAを分析した（補足表6）。 図2
22種の動物およびイノシシ/家畜豚から分離したDNA（10 ng/μL）との交差反応性試験を実施した結果です。 (A)assayChr9W, (B)assayChr9D, (C)assayChr1W, (D)assayChr1D.
各種市販マスターミックスの適用性のスクリーニング
次の一連の実験では、市販マスターミックスの種類はアッセイの選択性に影響するかについて検討しました。 イノシシ3個体、家畜ブタ11品種/交雑種を含む23種の動物から分離したDNAを、異なるサプライヤーから入手した合計5種類のマスターミックスで分析した。 マスターミックスとそれぞれの温度プログラムを補足表7に示す。 一般に、マスターミックスの種類は、標的種と交差反応（亜）種の間のCt値の絶対値およびΔCt値の両方に影響を及ぼした。 しかし、リアルタイムPCRアッセイでは、異なる程度に影響を受けた。 例えば、assayChr9Wの場合、mix2、3はmaster mix1（本研究の標準master mix）、4、5よりも高いCt値を示した（Ct ± SD（n = 6）：mix 1：25.03 ± 0.15; mix 2：31.17 ± 1.70; mix 3：28.43 ± 0.13; mix 4：26.64 ± 0.10; mix 5：26.64 ± 0.17 ）。 assayChr9Dの場合、マスターミックスの種類はΔCt値に影響を与え、アッセイの選択性に影響を及ぼした。 マスターミックス1，2，3，4で得られたΔCt値はそれぞれ≥ 8.41，≥ 10.40，≥ 7.18，≥ 5.86であったが，マスターミックス5では交差反応が全く観察されなかった． assayChr1では、マスターミックス1、3、4でほぼ同様のCt値が得られた。 しかし、マスターミックス2および5では、マルチプレキシングに適していないためか、産物が生成されなかった。
Robustness
アニーリング温度±1℃、ウェルあたりの反応液量±5%を変え、2種類のリアルタイムPCRサイクラーを用いて、リアルタイムPCRアッセイの頑健性を検討した。 実験は、イノシシ、家畜豚、ノロ鹿から分離したDNAを用いて行った。 assayChr9WおよびassayChr9Dでは、アニーリング温度を61℃に上昇させた場合（ΔCt値≦2.16、≦1.57）以外は標準状態で得られたCt値と非常によく似た値（ΔCt値＜3126＞1.00）となった。 ΔCt値が≤0.77となり、assayChr1はさらに堅牢であることが判明した。 総反応量を減らしても、別のリアルタイムPCRサイクラーを使用しても、Ct値に大きな影響はなく、リアルタイムPCRアッセイの頑健性が実証された。
Working range, linear range and amplification efficiency
Wild boar DNA isolate (211 µg/mL) and two domestic pig DNA isolate (158 µg/mL and 160 µg/mL) serially diluted in water (1.0 µg/mL) by analysing a wild boar DNA isolate (211 µg/mL) and two domestic pig DNA isolate (158 µg/mL and 160 µg/mL) as a wild boar DNA spinulate in water (1:2-1:524,288）、assayChr9W、assayChr9D、assayChr1W、assayChr1Dは211 µg/mL から13 ng/mL の間で直線性を示した（R2 = 0.1.0）。9948）、158 µg/mL と 10 ng/mL（R2 = 0.9981）、211 µg/mL と 6 ng/mL（R2 = 0.9994） および 160 µg/mL と 10 ng/mL（R2 = 0.9988） の間でそれぞれ線形性を示した（図 3A）。 標準曲線の傾きから算出した増幅効率は、それぞれ83%、96%、93%、95%であった。 また、ニシン精子DNAで連続希釈したイノシシおよび家畜豚DNA分離株を分析し、直線性の幅を評価した。 assayChr9W と assayChr9D では、直線性はそれぞれ 20 µg/mL から 20 ng/mL (R2 = 0.9988) と 20 µg/mL から 39 ng/mL (R2 = 0.9985) に及んだ (Fig. 3B) 。 assayChr1WとassayChr1Dの場合、直線性はそれぞれ20 µg/mLから5 ng/mL (R2 = 0.9978) と20 µg/mLから10 ng/mL (R2 = 0.9988) の範囲であった。 標準曲線の傾きから算出した増幅効率は、それぞれ76%、90%、97%、101%でした。
4種類のアッセイの直線性の範囲。（A）バックグラウンドとして水で測定、（B）非標的バックグラウンドDNAとしてニシン精子DNAで決定。
これらの結果から、リアルタイムPCRアッセイの作業範囲はほぼ同じであるが、9番染色体を標的とするアッセイは、1番染色体を標的とするアッセイよりも直線性の範囲が狭くなることがわかった。 増幅効率は、assayChr9W（水中83％、ニシン精子DNA中76％）を除き、ENGLガイドライン17で推奨されている90％から110％の間であった。
Limit of detection (LOD) in herring sperm DNA and pig DNA as background DNA
LODは20反復中少なくとも19反復で蛍光シグナルが増加する最低DNA濃度と定義された。 また、Ct値は交差反応する生物種で得られたCt値以下でなければならない。
ニシン精子DNAでは、assayChr9D（1.0％, w/w、Fig. 4A）は、他の3つのアッセイのLOD（0.2%, w/w、Fig. 4B-D）よりもわずかに高い。 assayChr9DのLODが高いのは、イノシシとの交差反応性（イノシシと家畜豚の間のΔCt値のみ≧8.41）によるものである。
(A-D) ニシン精子DNAにイノシシまたは家畜豚DNAを含むDNA混合物、(E-H) バックグラウンドDNAとして家畜豚DNAにイノシシDNAまたは家畜豚DNAを含むDNA混合物の連続希釈物を分析することによるLODの決定。 (A,E) は assayChr9D を用いて、(B,F) は assayChr9W を用いて、 (C,G) は assayChr1D を用いて、 (D,H) は assayChr1W を用いて得られたものである。 測定は20反復で行った。 丸印は個々のCt値、横線は平均値を示す。
また、イノシシ用のリアルタイムPCRアッセイであるassayChr1WおよびassayChr9Wについて、家畜ブタのDNAをバックグラウンドとした場合のLODと、イノシシ用DNAをバックグラウンドとした場合のassayChr1DおよびassayChr9Dについて測定したところ、いずれも平均値は1.5倍であった（図1）。 2%、0.2%、5%、2% (w/w)では、assayChr9D (Fig. 4E), assayChr9W (Fig. 4F), assayChr1D (Fig. 4G) and assayChr1W (Fig. 4H) のLODはかなり異なっていることが確認されました。 イノシシ DNA 存在下での assayChr1D の高い LOD は、シグナル抑制によるもので、おそらく二重アッセイ形式での標的配列に対する 2 つのプローブの競合が原因であると考えられた。 シグナル抑制をより詳細に調べるため、ポジティブコントロール（それぞれイノシシDNAと家畜ブタDNA）に加え、家畜ブタDNA中に25％（w/w）イノシシDNA、またはイノシシDNA中に25％（w/w）家畜ブタDNAを含むDNA混合物を分析した。
ポジティブコントロールと非標的DNAを含む1:4希釈した標準物質を比較したところ、assayChr9WとassayChr9Dでは増幅曲線（ΔRn値）に違いは見られなかった（図5A,B）。 しかし、assayChr1WとassayChr1Dの場合、ポジティブコントロールで得られた蛍光シグナル（ΔRn値）は、同じターゲットDNA濃度で1：4希釈したスタンダードで得られた蛍光シグナルより高かった（図5C、D）。
標的亜種（イノシシまたは家豚）25％（w/w）および非標的亜種（イノシシまたは家豚）75％（w/w）およびそれらの連続希釈（1：4〜1：1024）を含むDNA混合物（20 ng/μL）について得られた増幅曲線（半ログビュー）である。 対照として、イノシシおよび家畜豚からそれぞれ分離したDNA（5 ng/μL）を用いた。 AssayChr9W (A) および assayChr9D (B) は、非標的亜種との交差反応性を示す。
反復性
リアルタイムPCRアッセイの反復性は、標的DNA30％（w/w）と非標的亜種DNA70％（w/w）を含む肉エキス混合物、およびその連続希釈物を、4日間に5度反復して分析することによって調査した。 Ct値のRSDは、≦1.0% (assayChr1W), ≦1.9% (assayChr9W), ≦2.3% (assayChr1D), ≦3.5% (assayChr9D) であり、高い再現性が示された。
イノシシおよび家畜豚個体のサンプル分析
14品種と6交雑種を含む家畜豚64個体のサンプル分析に、リアルタイムPCRアッセイを適用した（図6A）。 さらに、5カ国（オーストリア、エストニア、ドイツ、ルーマニア、米国、図6B）のイノシシ計30個体の試料を分析した。 ヨーロッパ産のイノシシ1個体の場合、正確な起源は不明であった。 各試料は少なくとも4回反復して分析された。 各PCRプレートには、カットオフCt値を提供するLODと同じ濃度のターゲット亜種を含む陽性対照（DNA混合物、10ng/μL）が加えられた
(A) 64匹の家豚と(B) 30匹のイノシシ試料で得られた結果。 測定は少なくとも4反復で実施。
14反復で陽性対照を分析したところ、Ct値の平均±SDは33.85 ± 0.93 (assayChr9W), 35.19 ± 1.11 (assayChr9D), 32.89 ± 0.28 (assayChr1W) and 32.60 ± 0.47 (assayChr1D) であった。 assayChr9Dを除き、Ct値が高くなったサンプルはすべて<LODとみなされた。 assayChr9Dの場合、複数のイノシシ試料でCt値34.61以上が得られている。 偽陽性の確率を下げるため、assayChr9DのカットオフCt値を34.00に設定した。 assayChr9WおよびassayChr9Dをルーチン分析に適用する場合、2% (w/w) の家畜豚DNA、0.2% (w/w) のイノシシDNA、97.8% (w/w) のニシン精子DNAからなる陽性対照を用いることが望ましい。
assayChr9Dによる家畜豚試料の分析では63件の陽性結果とわずか1件の陰性結果 (Mangalica1) を得た（図6）。 Cinta Seneseの12個体から、赤身のサンプル（最長筋）と皮下脂肪のサンプル（ロース）の2種類の肉部分を分析した（データは示していない）。 赤身サンプルで得られたCt値（平均Ct±SD 25.24 ± 0.44, n = 48）は、背部皮下脂肪サンプル（26.29 ± 0.35, n = 48）の値と非常によく似ていました。 イノシシ30検体をassayChr9Dで分析したところ、21検体は蛍光シグナルの増加が見られなかったが、9個体（オーストリア1、ドイツ5、米国3）が家畜豚と同定された。
assayChr9Wでは、3検体（ドイツ1、米国2）でのみ陰性結果が得られ、大部分のイノシシ検体が正しく同定された。 しかし、Bentheim Black Pied 1頭、Krškopolje 3頭、Mangalica 3頭など、一部の家畜豚については、assayChr9Wによって陽性結果が得られた。 特に、オーストリア産のマンガリッツァ豚3頭は家畜豚と同定されたが、ドイツ産の3頭はイノシシと同定された。 assayChr9W と assayChr9D を含む assayChr9 の場合、94 個の食肉サンプルのうち 12 個は、両方の real-time PCR アッセイで蛍光シグナルの増加が得られたため、あいまいな結果になった。 さらに、マンガリッツァ豚1個体がイノシシ、イノシシ3個体が家畜豚と同定された。
Beuginらの研究11では、フランスのヴォージュ地方の自然公園で狩猟した「純粋」イノシシと限られた商業豚品種（ランドレース、Large White、Pietrain、Duroc）でSNP rs81416363の適合性を検証している。
なぜassayChr9WとassayChr9Dがいくつかの誤判定やあいまいな結果をもたらすのかを調べるために、それぞれのイノシシと家畜のサンプルを高解像度融解（HRM）分析によって遺伝子型判定を行った。 HRM解析は、SNPジェノタイピングのための強力かつ時間的・費用的効率の高い手法であるため、これを適用しました18。 正規化融解曲線（図 7A）から、ホモ接合型 G 遺伝子型はイノシシ試料だけでなく、マンガリカ 試料（試料 1）でも検出され、その蛍光シグナルは assayChr9W では増加したが assayChr9D では減少したことがわかる。 assayChr9Dで蛍光シグナルが増加したイノシシ試料は、少なくとも1コピーのA対立遺伝子を保有していることが判明した。 イノシシの4個体がヘテロ接合型、5個体がホモ接合型であった。 また、スロベニアのKrškopoljeの3個体を含む家畜豚5個体は、AおよびG対立遺伝子の両方を保有していることが判明した。 このように、HRMジェノタイピングにより、assayChr9WおよびassayChr9Dで得られた結果が、それぞれの個体の遺伝子型と一致していることを確認することができた。 しかし、今回の結果から、SNP rs81416363を標的とした2つのシングルプレックスアッセイ、assayChr9WとassayChr9Dでは、イノシシと家畜豚を明確に識別できないことが示された＜94＞＜8003＞＜5612＞＜6544＞図7＜9057＞＜8003＞＜4187＞＜248＞＜8003＞＜7079＞正規化HRMカーブ (A)SNP rs81614363 (g.118314929 A > G) の9番染色体上のホモ接合体G（イノシシ）、ホモ接合体A（家畜豚）、ヘテロ接合体A + G、および（B）SNP g.299084751 1番染色体上のC > Tをホモ接合体C（イノシシ）、ホモ接合体T（家畜豚）、ヘテロ接合体C + Tとした。
assayChr1Dにより、3検体を除くすべての家畜豚を分類した（図6）。 assayChr9Dにより、チンタ・セネーゼ12個体の赤身および背部皮下脂肪試料で得られたCt値は非常に類似していた（平均Ct±SDはそれぞれ25.99±0.25（n = 48）および26.36±0.25（n = 48））。 しかし、assayChr1Dでは、イノシシ30検体のうち5検体が家畜豚と同定された。 また、assayChr1Wによるイノシシ試料の分析では、1件のみ陰性と判定された。 しかし、Mangalicaの1サンプルとTuropoljeの6個体でも、assayChr1Wで蛍光信号が増加した。
Fontanesiらの研究10では、SNP g.299084751 C > T は、5つの商業品種（Italian Large White, Italian Landrace, Italian Duroc, Belgian Landrace, Piétrain）の293頭の家豚と南中欧（北イタリア）および南東欧（スロベニアおよび西バルカン地域）の201頭の野ブタのサンプルを分析して、遺伝子型を決定していた。 Fontanesiらは、すべての家畜豚の個体がT対立遺伝子に対してホモ接合であることを見いだした。 イノシシでは7.5％の個体が少なくとも1コピーのT対立遺伝子を持っており、南中欧の個体（3.6％）よりも南東欧の個体（12.2％）の方がより多かった。
HRM分析でSNP g.299084751 C > Tについてイノシシと家畜豚の個体を遺伝子型判定したところ、家畜豚だけでなく一部のイノシシでもTアレルを検出した(図7B)． 米国産のイノシシ個体はホモ接合性のT遺伝子型を示したが、ニーダーエステリア産のイノシシ個体はCとTの両方の対立遺伝子を有していた。 しかし、大半のイノシシ個体はC対立遺伝子をホモ接合で持っていた。 この結果は、assayChr1Dで得られた3つのイノシシ試料（ドイツBad KissingenとPerleberg、およびヨーロッパ）の蛍光信号の増加は、遺伝子型によらず、交差反応によるものであることを示している。 家畜ブタの個体の大部分はTアレルのホモ接合体であることが確認された。 しかし、Turopolje の 8 個体のうち 6 個体は C/T のヘテロ接合型であることが判明し、 assayChr1D と assayChr1W の両方で蛍光信号の増加が得られた理由が説明された。 クロアチアの家畜豚であるTuropoljeでヘテロ接合型C/T遺伝子型の頻度が高いことは、Fontanesiの研究グループによるごく最近の論文と一致する。 Turopoljeの47個体のジェノタイピングにより、Tアレルの頻度は0.57、Cアレルの頻度は0.43と報告されている19。
我々の結果は、SNP rs81416363を標的とする2つのシングルプレックスアッセイとSNP g.299084751 C > Tを標的とするダブルアッセイだけでは、イノシシと家豚を明確に識別できないことを示す。 しかし、2つのsingleplex assayとduplex assayの結果を考慮することにより、識別力を飛躍的に向上させることが可能である。 その結果、同じ亜種に対する2つのアッセイ（例えば、assayChr9DとassayChr1D）が同一の分類（与えられた例では家畜豚）を導き、他の亜種に対する2つのアッセイ（与えられた例ではassayChr9WとassayChr1W）で得られた結果があいまいであれば、同一の結果に依存すれば誤分類の確率は低いことが実証されました。 この方法により、94個体中86個体（91.5%）を正しく分類することができた
。