Differentiering mellem vildsvin og tamsvin i fødevarer ved at målrette to genloci ved realtids-PCR

Design af primer og sonde

For design af primer og sonde valgte vi polymorfismer, der allerede var blevet rapporteret for at gøre det muligt at skelne mellem vildsvin og tamsvin. Vi startede med SNP’en g.299084751 C > T i NR6A1-genet, som har vist sig at være forbundet med antallet af bryst- og lændehvirvler: vildsvin, som er homozygote for wild type-allelen g.299084751 C, har 19 ryghvirvler, mens tamsvin, som er homozygote for g.299084751 T, har 21-23 ryghvirvler. I undersøgelsen af Fontanesi et al. blev denne SNP anvendt til at skelne mellem vildsvin og tamsvin ved hjælp af PCR-RFLP10. Vi havde til formål at designe et primerpar til amplifikation af målregionen i både vildsvin og tamsvin og to TaqMan-sonder, der var specifikke for henholdsvis vildsvineallelen (g.299084751 C) og tamsvineallelen (g.299084751 T). Duplex-assayet skulle gøre det muligt at påvise vildsvin og tamsvin samtidig i en og samme brønd. I alt designede vi fire fremadrettede primere, tre omvendte primere, fire vildsvinssonder og en tamsvinssonde og kombinerede dem til 21 primer/sondersystemer (Chr1a – u, Supplerende tabel 1). Primer/sonderingssystem Chr1a var rettet mod den øverste streng og primer/sonderingssystem Chr1b-u mod den nederste streng af NR6A1-genet. I en række forsøg undersøgte vi, om primer/sondersystemerne var specifikke for vildsvin eller viste krydsreaktivitet med tamgrisracer/krydsningsracer. Primer/sonderingssystem Chr1a resulterede i en ΔCt-værdi ≥ 10,56 mellem tamsvin og vildsvin (Supplerende tabel 2). For primer/sonderingssystemerne Chr1i – o varierede ΔCt-værdierne fra 8,65 til 11,19. Primer/sonderingssystemerne Chr1b – h og Chr1p – t resulterede ikke i en forøgelse af fluorescenssignalet for husgrisracer/krydsningsracer. Da primer/sonderingssystemet Chr1q resulterede i den laveste Ct-værdi (24,77; n = 2) for vildsvin, testede vi dets anvendelighed i kombination med en TaqMan-sonde for tamsvin i duplex-assayformatet (primer/sonderingssystem Chr1u, supplerende tabel 1). Da Ct-værdierne for både vildsvin (26,21, n = 2) og tamsvin (27,90, n = 2) var tilfredsstillende, blev alle yderligere PCR-eksperimenter rettet mod SNP g.299084751 C > T udført med primer/probe-system Chr1u. I det følgende kaldes duplex realtids-PCR-assayet for assayChr1, der består af assayet for tamsvin, assayChr1D, der omfatter fremadrettet primer Chr1f4, omvendt primer Chr1r2 og sonde Chr1p1D, og assayet for vildsvin, assayChr1W, der omfatter fremadrettet primer Chr1f4, omvendt primer Chr1r2 og sonde Chr1p4W (fig. 1A).

Partielle sekvenser af (A) NR6A1-genet på kromosom 1, der bærer SNP g.299084751 C > T, der er målrettet med duplexassayet “assayChr1”, og (B) kromosom 9, der bærer SNP’en g.118314929 A > G (rs81416363), der er målrettet med de to singleplexassays “assayChr9D” og “assayChr9W”. Pilene angiver positionerne for primerne (mørkegråt) og proberne (lysegråt). (A) Duplex assayChr1 omfattede fremadrettet primer Chr1f4, omvendt primer Chr1r2, sonde Chr1p4W og sonde Chr1p1D. (B) Singleplex-assayChr9D omfattede fremadrettet primer Chr9f8, omvendt primer Chr9r17D og sonde Chr9p2; singleplex-assayChr9W omfattede fremadrettet primer Chr9f8, omvendt primer Chr9r12W og sonde Chr9p2. Underartsspecifikke baser er vist med fed skrift (lodrette røde pile) og mismatch-baser med blå skrift (lodrette blå pile).

Da vi fra litteraturen havde erfaret, at diskriminationsevnen ved kun at målrette mod én polymorfi højst sandsynligt ikke er tilstrækkelig, søgte vi efter et yderligere egnet genlokus. Ved at undersøge 20 SNP’er for deres anvendelighed til at skelne mellem vildsvin og tamsvin havde Beugin et al. fundet, at SNP’erne rs80864596 (intergenisk, kromosom 5), rs80796712 (glycogensyntase kinase 3-beta, kromosom 13) og rs81416363 (intergenisk, kromosom 9) udviste den højeste diskriminationskraft11. Vi valgte derfor disse tre SNP’er til udformning af primer/sondersystemer. Sammenlignet med primer/probe-design for SNP g.299084751 C > T fulgte vi en anden strategi. I stedet for at placere den underartsspecifikke base i sonden placerede vi den på det næstsidste sted fra 5′-enden af den fremadrettede eller den omvendte primer. For at øge specificiteten indførte vi bevidst basemismatches. Denne såkaldte MAMA-teknik (mismatch amplification mutation assay)12,13 har den fordel, at den er ret omkostningseffektiv, fordi en og samme sonde kan testes med en række primere, der adskiller sig fra hinanden med hensyn til mismatch-positionen. I den første forsøgsserie indførte vi mismatchbasen enten i 3′- eller 6′-positionen fra 3′-enden af den primer, der bærer den underartsspecifikke base. Da vi havde udviklet realtids-PCR-assays for henholdsvis kronhjort, dådyr og sikahjort14,15,16 , havde denne strategi vist sig at være en succes. I den foreliggende undersøgelse var der imidlertid ingen af primer/sondersystemerne (Chr5b – d, Chr13b – c, Chr9b – g, Chr9i – n, Supplerende tabel 1), der gjorde det muligt at skelne mellem tamsvin og vildsvin (Supplerende tabel 3). De bedste resultater (ΔCt-værdi mellem tamgrisracer/krydsninger og vildsvin ≥5,24) blev opnået med primer/sonderingssystem Chr9j. I dette primer/sonderingssystem, der er rettet mod SNP’en rs81416363 på kromosom 9, var mismatchbasen placeret i tredje position fra 3′-enden af primeren (TTCACG → TTCCCG). For at øge specificiteten indførte vi en yderligere mismatch i fjerde (TTCACG → TTGCCG, TTGCCG, TTACCG, TTTCCG) eller femte position (TTCACG → TACCCG, TCCCCG, TGCCCG) fra 3′-enden af primeren. Indførelsen af yderligere mismatches viste sig at være en succes. Med primer/sondersystem Chr9r (Supplerende tabel 1) opnåede vi både den laveste Ct-værdi for vildsvin (22,09; n = 2) og den højeste ΔCt-værdi (10,52) mellem tamgrisracer/krydsninger og vildsvin (Supplerende tabel 3). Dette realtids-PCR-assay for vildsvin, der var rettet mod SNP rs81416363 på kromosom 9, var baseret på primer/sonderingssystemet Chr9r (Chr9f8, Chr9r12W, Chr9p2).

Næst anvendte vi MAMA-strategien til at udvikle det tilsvarende realtids-PCR-assay, der var rettet mod SNP rs81416363 på kromosom 9, for tamsvin. Vi placerede den husgrisespecifikke base på den næstsidste base fra 5′-enden af primeren og mismatchbasen på den tredje position fra 3′-enden (primer/sondersystemer Chr9v – x; Supplerende tabel 1). Indførelsen af én mismatchbase var imidlertid ikke tilstrækkelig til at gøre det muligt at skelne mellem tamsvin og vildsvin. Indførelsen af mismatchbaser på 3. og 5. position fra 3′-enden af primeren (primer/sonderingssystemer Chr9y – ag) førte til en ΔCt-værdi ≥ 4,83. Når mismatches var på position 3 og 4 (primer/sondersystemer Chr9ah – aj), var ΔCt-værdien ≥5,85. Ved at indføre tre på hinanden følgende mismatchbaser ved siden af den underartsspecifikke base (primer/sonderingssystemer Chr9ak – am) kunne specificiteten øges. Primer/sonderingssystem Chr9ak, hvor mismatchningerne var på position 3, 4 og 5 (TTCATG → TGGTTG), førte til den højeste ΔCt-værdi på ≥9,97. Alle yderligere eksperimenter blev derfor udført med primer/sondersystem Chr9ak. I det følgende omtales de to singleplex-assays, der er rettet mod SNP’en rs81416363 på kromosom 9, som assayChr9D, herunder fremadrettet primer Chr9f8, omvendt primer Chr9r17D og sonde Chr9p2, og assayChr9W, herunder fremadrettet primer Chr9f8, omvendt primer Chr9r12W og sonde Chr9p2 (fig. 1B).

Optimering af primer/probe-koncentration og -forhold

Alle ovenstående resultater blev opnået med primer- og sondekoncentrationer på henholdsvis 500 nM og 200 nM (primer/probe-systemer rettet mod kromosom 1) og 200 nM og 100 nM (primer/probe-systemer rettet mod kromosom 5, 9 og 13). Dernæst undersøgte vi, om specificiteten af realtids-PCR-assaysene kunne øges ved at optimere primer/probe-koncentrationen og -forholdet. For assayChr1 blev det konstateret, at de optimale primer- og sondekoncentrationer var henholdsvis 1 000 nM og 200 nM (supplerende tabel 4). For assayChr9W og assayChr9D resulterede et overskud af primeren med både den underartsspecifikke base og mismatchbaserne i højere ΔCt-værdier mellem den krydsreagerende underart og målarten. Den højeste selektivitet for assayChr9W og assayChr9D blev opnået med fremadrettede primer/omvendt primer/sondekoncentrationer på henholdsvis 12,5/200/50 nM og 62,5/800/50 nM.

Krydsreaktivitetstest

Næst udførte vi krydsreaktivitetstest med DNA-isolater fra vildsvin, forskellige tamgrisracer/krydsninger og yderligere 22 dyrearter, der er anført i supplerende tabel 5. Figur 2A-D viser de amplifikationskurver, der er opnået med henholdsvis assayChr9W, assayChr9D, assayChr1W og assayChr1D. AssayChr9W viste en svag krydsreaktivitet med tamsvin, sikahjorte, alpine stenbukke, får, geder og gemser (ΔCt ≥ 12,10, n = 2), assayChr9D med vildsvin, sikahjorte, elge, heste og kalkuner (ΔCt ≥ 8,41, n = 4). I modsætning til de assays, der er rettet mod SNP’en rs81416363 på kromosom 9, viste assayChr1 ingen krydsreaktivitet (med undtagelse af assayChr1W for rådyr i kun én ud af fire replikater). Vi analyserede også DNA-isolater fra 50 plantearter, der almindeligvis anvendes som fødevareingredienser (Supplerende tabel 6). Ingen af assaysene viste krydsreaktivitet med nogen af plantearterne.

Resultater opnået ved at udføre krydsreaktivitetstest med DNA-isolater (10 ng/µL) fra 22 dyrearter og vildsvin/husgris. (A) assayChr9W, (B) assayChr9D, (C) assayChr1W og (D) assayChr1D.

Screening af forskellige kommercielle masterblandinger for deres anvendelighed

I en næste række forsøg undersøgte vi, om typen af den kommercielle masterblanding påvirkede selektiviteten af assaysene. Vi analyserede DNA-isolater fra 23 dyrearter, herunder 3 vildsvineindivider og 11 racer/krydsninger af tamsvin, med i alt fem masterblandinger fra forskellige leverandører. Masterblandingerne og de respektive temperaturprogrammer er angivet i den supplerende tabel 7. Generelt havde typen af mastermixet indflydelse på både de absolutte Ct-værdier og ΔCt-værdierne mellem mål- og krydsreagerende (under)arter. Realtids-PCR-assaysene blev imidlertid påvirket i forskelligt omfang. For assayChr9W resulterede mix 2 og 3 f.eks. i højere Ct-værdier end mastermix 1 (standardmastermixet i den foreliggende undersøgelse), 4 og 5 (Ct ± SD (n = 6): mix 1: 25,03 ± 0,15; mix 2: 31,17 ± 1,70; mix 3: 28,43 ± 0,13; mix 4: 26,64 ± 0,10; mix 5: 26,64 ± 0,17). I forbindelse med assayChr9D havde typen af mastermix indflydelse på ΔCt-værdierne og dermed assayets selektivitet. De ΔCt-værdier, der blev opnået med mastermix 1, 2, 3 og 4, var henholdsvis ≥ 8,41, ≥ 10,40, ≥ 7,18 og ≥ 5,86, mens der med mastermix 5 slet ikke blev observeret nogen krydsreaktivitet. For assayChr1 blev der opnået ret ensartede Ct-værdier med mastermix 1, 3 og 4. Master mix 2 og 5 resulterede imidlertid ikke i dannelse af nogen produkter, sandsynligvis fordi disse mix ikke er egnede til multiplexing. På baggrund af disse resultater anbefales det stærkt at teste anvendeligheden, hvis det er hensigten at anvende en anden type mastermix.

Robusthed

Robustheden af realtids-PCR-assaysene blev undersøgt ved at variere annealingstemperaturen ±1 °C og mængden af reaktionsblandingen pr. brønd med ±5 % og ved at anvende to forskellige realtids-PCR-cyklere. Forsøgene blev udført med DNA-isolater fra vildsvin, tamsvin og rådyr. For assayChr9W og assayChr9D var Ct-værdierne meget lig dem, der blev opnået under standardbetingelser (ΔCt-værdier <1,00), undtagen når annealingstemperaturen blev øget til 61 °C (ΔCt-værdier ≤2,16 og ≤1,57, henholdsvis). Med ΔCt-værdier ≤0,77 viste assayChr1 sig at være endnu mere robust. Hverken nedskalering af det samlede reaktionsvolumen eller brug af en anden realtids-PCR-cycler havde nogen væsentlig indflydelse på Ct-værdierne, hvilket viser realtids-PCR-assayernes robusthed.

Arbejdsområde, lineært område og amplifikationseffektivitet

Ved analyse af et vildsvine-DNA-isolat (211 µg/mL) og to DNA-isolater fra tamsvin (158 µg/mL og 160 µg/mL), der er serielt fortyndet i vand (1:2-1:524,288), var assayChr9W, assayChr9D, assayChr1W og assayChr1D lineære mellem 211 µg/mL og 13 ng/mL (R2 = 0.9948), 158 µg/mL og 10 ng/mL (R2 = 0,9981), 211 µg/mL og 6 ng/mL (R2 = 0,9994) og 160 µg/mL og 10 ng/mL (R2 = 0,9988), henholdsvis (fig. 3A). Amplifikationsvirkningerne beregnet ud fra standardkurvernes hældninger var henholdsvis 83 %, 96 %, 93 % og 95 %. Desuden blev linearitetsområdet evalueret ved at analysere isolater af vildsvine- og tamsvine-DNA, der var serielt fortyndet i DNA fra sildesæd. For assayChr9W og assayChr9D varierede lineariteten fra henholdsvis 20 µg/mL til 20 ng/mL (R2 = 0,9988) og 20 µg/mL til 39 ng/mL (R2 = 0,9985) (fig. 3B). For assayChr1W og assayChr1D var lineariteten henholdsvis i intervallet fra 20 µg/mL til 5 ng/mL (R2 = 0,9978) og fra 20 µg/mL til 10 ng/mL (R2 = 0,9988). Amplifikationseffektiviteten beregnet ud fra standardkurvernes hældninger var henholdsvis 76 %, 90 %, 97 % og 101 %.

Linearitetsområde for de fire assays, (A) bestemt i vand som baggrund og (B) bestemt i sildesæd-DNA som baggrunds-DNA uden for målgruppen.

Disse resultater viser, at arbejdsområdet for realtids-PCR-assaysene er næsten identisk, mens linearitetsområdet er smallere for assays, der er rettet mod kromosom 9, end for dem, der er rettet mod kromosom 1. Alle amplifikationseffektiviteter var på mellem 90 % og 110 %, som anbefalet i ENGL-retningslinjerne17 , undtagen for assayChr9W (83 % i vand, 76 % i sildesæd-DNA). Den lavere amplifikationseffektivitet for assayChr9W skyldes højst sandsynligt nedsat primerbindingsstabilitet på grund af mismatches, der er indført for at øge selektiviteten for måldyrsarten.

Detektionsgrænse (LOD) i sildesæd-DNA og svine-DNA som baggrunds-DNA

LOD blev defineret som den laveste DNA-koncentration, der resulterede i en stigning i fluorescenssignalet i mindst 19 ud af 20 replikater. Desuden skal Ct-værdien være under den Ct-værdi, der er opnået for krydsreagerende arter.

I sildesæd-DNA var LOD for assayChr9D (1,0 %, w/w, Fig. 4A) var lidt højere end LOD for de tre andre assays (0,2 %, w/w, fig. 4B-D). Den højere LOD for assayChr9D skyldes krydsreaktiviteten med vildsvin (ΔCt-værdi mellem vildsvin og tamsvin kun ≥8,41).

Bestemmelse af LOD ved analyse af serielle fortyndinger af (A-D) DNA-blandinger, der indeholder vildsvine- eller tamsvine-DNA i sildesæd-DNA, og (E-H) en DNA-blanding, der indeholder vildsvine-DNA i tamsvine-DNA eller tamsvine-DNA i vildsvine-DNA som baggrunds-DNA. (A,E) blev opnået ved anvendelse af assayChr9D, (B,F) ved anvendelse af assayChr9W, (C,G) ved anvendelse af assayChr1D og (D,H) ved anvendelse af assayChr1W. Målingerne blev udført i 20 gentagelser. Cirkler repræsenterer individuelle Ct-værdier, vandrette linjer angiver gennemsnitsværdierne.

Dertil kommer, at vi bestemte LOD for realtids-PCR-assays for vildsvin, assayChr1W og assayChr9W, i DNA fra tamsvin som baggrund, og for assays for tamsvin, assayChr1D og assayChr9D, i DNA fra vildsvin som baggrund. Med 2 %, 0,2 %, 5 % og 2 % (w/w) var LOD’erne for assayChr9D (fig. 4E), assayChr9W (fig. 4F), assayChr1D (fig. 4G) og assayChr1W (fig. 4H) ret forskellige. Den højere LOD-værdi for assayChr1D i tilstedeværelse af vildsvine-DNA skyldtes signalundertrykkelse, sandsynligvis på grund af de to proberes konkurrence om målsekvensen i duplex-assay-formatet. For at undersøge signalundertrykkelse mere detaljeret blev DNA-blandinger, der indeholdt enten 25 % (w/w) vildsvine-DNA i DNA fra tamsvin eller 25 % (w/w) DNA fra tamsvin i vildsvine-DNA, analyseret ud over positive kontroller (henholdsvis vildsvine-DNA og DNA fra tamsvin).

Når vi sammenlignede de positive kontroller med de 1:4 fortyndede standarder, der indeholdt ikke-mål-DNA, fandt vi ingen forskel i amplifikationskurverne (ΔRn-værdier) for assayChr9W og assayChr9D (Fig. 5A,B). For assayChr1W og assayChr1D var de fluorescenssignaler (ΔRn-værdier), der blev opnået for den positive kontrol, imidlertid højere end de fluorescenssignaler, der blev opnået for den 1:4 fortyndede standard ved samme mål-DNA-koncentration (fig. 5C,D).

Amplifikationskurver (i semi log visning) opnået for DNA-blandinger (20 ng/µL) indeholdende 25 % (w/w) af målunderarten (vildsvin eller tamsvin) og 75 % (w/w) af ikke-målunderarten (vildsvin eller tamsvin) og serielle fortyndinger heraf (1:4 til 1:1,024). DNA-isolater (5 ng/µL) fra henholdsvis vildsvin og tamsvin blev anvendt som kontrol. AssayChr9W (A) og assayChr9D (B) viser krydsreaktivitet med den ikke-målunderart. AssayChr1W (C) og assayChr1D (D) viser signalundertrykkelse ved tilstedeværelse af ikke-målunderarter.

Gentagelighed

Gentageligheden af realtids-PCR-assays blev undersøgt ved at analysere kødekstraktblandinger, der indeholdt 30 % (w/w) mål-DNA og 70 % (w/w) DNA fra ikke-målunderarter samt serielle fortyndinger heraf, i dubletter fem gange på fire forskellige dage. RSD for Ct-værdierne var ≤1,0 % (assayChr1W), ≤1,9 % (assayChr9W), ≤2,3 % (assayChr1D) og ≤3,5 % (assayChr9D), hvilket viser den høje repeterbarhed af analyserne.

Analyse af prøver fra individer af vildsvin og tamsvin

De realtids-PCR-assays blev anvendt til analyse af prøver fra 64 individer af tamsvin, herunder 14 racer og 6 krydsninger af racer (Fig. 6A). Desuden analyserede vi i alt 30 vildsvineprøver fra 5 forskellige lande (Østrig, Estland, Tyskland, Rumænien og USA, Fig. 6B). For et enkelt vildsvineindivid fra Europa var den nøjagtige oprindelse ukendt. Hver prøve blev analyseret i mindst fire gentagelser. Til hver PCR-plade blev der tilsat en positiv kontrol (DNA-blanding, 10 ng/µL), som indeholdt målunderarten i samme koncentration som LOD-værdien, hvilket gav cut-off Ct-værdien.

Resultater opnået for (A) 64 prøver af tamsvin og (B) 30 prøver af vildsvin. Målingerne blev udført i mindst fire gentagelser.

Da vi analyserede de positive kontroller i 14 gentagelser, var gennemsnittet ± SD for Ct-værdierne 33,85 ± 0,93 (assayChr9W), 35,19 ± 1,11 (assayChr9D), 32,89 ± 0,28 (assayChr1W) og 32,60 ± 0,47 (assayChr1D). Med undtagelse af assayChr9D blev alle prøver, der resulterede i højere Ct-værdier, betragtet som <LOD. For assayChr9D blev der for flere vildsvineprøver opnået Ct-værdier ≥ 34,61 for flere prøver af vildsvin. For at mindske sandsynligheden for falske positive resultater satte vi cut-off Ct-værdien for assayChr9D til 34,00. Til anvendelse af assayChr9W og assayChr9D i rutineanalyser anbefaler vi at anvende en positiv kontrol bestående af 2 % (w/w) DNA fra tamsvin, 0,2 % (w/w) DNA fra vildsvin og 97,8 % (w/w) DNA fra sildesæd.

For analysen af prøver fra tamsvin med assayChr9D opnåede vi 63 positive og kun ét negativt resultat (Mangalica 1) (fig. 6). Fra de 12 Cinta Senese-individer analyserede vi to forskellige køddele, en magert prøve (fra longissimus dorsi) og en prøve af subkutant rygfedt (fra lænden) (data ikke vist). De Ct-værdier, der blev opnået for magre prøver (gennemsnitlig Ct ± SD på 25,24 ± 0,44, n = 48), var meget lig dem for subkutane rygfedtprøver (26,29 ± 0,35, n = 48). Da vi analyserede de 30 vildsvineprøver med assayChr9D, resulterede 21 ikke i en stigning i fluorescenssignalet, men ni individer (en fra Østrig, fem fra Tyskland og tre fra USA) blev identificeret som tamsvin.

Med assayChr9W blev størstedelen af vildsvineprøverne tildelt korrekt, kun for tre prøver (en fra Tyskland og to fra USA) opnåede vi negative resultater. AssayChr9W førte imidlertid også til positive resultater for nogle individer af tamsvin, herunder et Bentheim Black Pied-vin, tre Krškopolje- og tre Mangalica-svin. Især blev de tre Mangalica-svin fra Østrig identificeret som tamsvin, mens de tre individer fra Tyskland blev identificeret som vildsvin. Hvad angår assayChr9, herunder assayChr9W og assayChr9D, gav 12 ud af de 94 kødprøver tvetydige resultater, fordi der blev opnået en stigning i fluorescenssignalet med begge realtids-PCR-assays. Desuden blev et Mangalica-svineindivid identificeret som vildsvin og tre vildsvineindivider som tamsvin.

I undersøgelsen af Beugin et al.11 var SNP rs81416363’s egnethed blevet testet på “rene” vildsvin, der blev jaget i en naturpark i Vosges i Frankrig, og et begrænset antal kommercielle svineracer (Landrace, Large White, Piétrain og Duroc). Vildsvin viste sig at være bærere af G-allelen (frekvens 100 %, ingen heterozygotitet) og tamsvin af A-allelen (frekvens 98 %, heterozygotitet 5 %).

For at finde ud af, hvorfor assayChr9W og assayChr9D førte til flere fejlklassifikationer og nogle tvetydige resultater, genotypede vi de respektive prøver af vildsvin og tamsvin ved hjælp af højopløsende smeltning (HRM-analyse). Vi anvendte HRM-analyse, fordi det er en kraftfuld, tids- og omkostningseffektiv teknik til SNP-genotypebestemmelse18. De normaliserede smeltningskurver (fig. 7A) viser, at den homozygote G-genotype ikke kun blev fundet for vildsvineprøverne, men også for Mangalica-prøven (prøve 1), for hvilken der blev opnået en stigning i fluorescenssignalet med assayChr9W, men ikke med assayChr9D. Vildsvineprøver, der resulterede i en stigning i fluorescenssignalet med assayChr9D, viste sig at være bærere af mindst én kopi af Aallelen. Fire vildsvineindivider viste den heterozygote genotype, mens fem var homozygote for Aallelen. Desuden blev det konstateret, at fem individer af tamsvin, herunder tre Krškopolje-individer fra Slovenien, var bærere af både A og G-allelen. Ved hjælp af HRM-genotypebestemmelse kunne vi således verificere, at de resultater, der blev opnået med assayChr9W og assayChr9D, var i overensstemmelse med de respektive genotyper af individerne. Vores resultater viser imidlertid, at de to singleplex-assays, der er rettet mod SNP rs81416363, assayChr9W og assayChr9D, ikke gør det muligt at skelne entydigt mellem vildsvin og tamsvin.

Normaliserede HRM-kurver for (A) SNP rs81614363 (g.118314929 A > G) på kromosom 9 for homozygot G (vildsvin), homozygot A (tamsvin) og heterozygot A + G og (B) SNP g.299084751 C > T på kromosom 1 for homozygot C (vildsvin), homozygot T (tamsvin) og heterozygot C + T.

Med assayChr1D blev alle prøver af tamsvin undtagen tre klassificeret som tamsvin (fig. 6). I overensstemmelse med assayChr9D var Ct-værdierne, der blev opnået for magre og subkutane rygfedtprøver fra de 12 Cinta Senese-individer, meget ens (gennemsnitlig Ct ± SD på henholdsvis 25,99 ± 0,25 (n = 48) og 26,36 ± 0,25 (n = 48)). Med assayChr1D blev fem ud af de 30 vildsvineprøver imidlertid også identificeret som tamsvin. Analysen af vildsvineprøver med assayChr1W førte kun til ét negativt resultat. Imidlertid førte også en Mangalica-prøve og seks Turopolje-individer til en stigning i fluorescenssignalet med assayChr1W.

I undersøgelsen af Fontanesi et al.10 førte SNP’en g.299084751 C > T var blevet genotypet ved at analysere prøver fra 293 tamsvin af fem kommercielle racer (Italian Large White, Italian Landrace, Italian Duroc, Belgian Landrace og Piétrain) og 201 vildsvin fra det sydlige Centraleuropa (Norditalien) og det sydøstlige Europa (Slovenien og regionerne på Vestbalkan). Fontanesi et al. fandt, at alle individer af tamsvin var homozygote for T-allelen. 7,5 % af vildsvineindividerne bar mindst én kopi af T-allelen, idet individer fra Sydøsteuropa var hyppigere (12,2 %) end individer fra Syd Centraleuropa (3,6 %). 11,1 % af vildsvinene fra Sydøsteuropa var af den heterozygote C/T-genotype.

Når vi genotypede vildsvine- og tamsvineindividerne for SNP g.299084751 C > T ved HRM-analyse, påviste vi også T-allelen ikke kun hos tamsvin, men også hos nogle vildsvin (Fig. 7B). Vildsvineindividet fra USA viste den homozygote T-genotype, mens vildsvineindividet fra Niederösterreich bar både C og T-allelen. Størstedelen af vildsvineindividerne var imidlertid homozygote for C allelen. Dette resultat viser, at stigningen i fluorescenssignalet for tre vildsvineprøver (Tyskland Bad Kissingen og Perleberg samt Europa), der blev opnået med assayChr1D, ikke var i overensstemmelse med deres genotype og derfor skyldtes krydsreaktivitet. Det blev konstateret, at størstedelen af tamsvinene var homozygote for T-allelen. Seks ud af otte Turopolje-individer viste imidlertid den heterozygote C/T-genotype, hvilket forklarer, hvorfor der blev opnået en stigning i fluorescenssignalet med både assayChr1D og assayChr1W. Den høje frekvens af den heterozygote C/T-genotype i Turopolje, en husdyrrace fra Kroatien, er i overensstemmelse med en meget nylig artikel fra Fontanesis forskningsgruppe. Ved genotypning af 47 Turopolje-individer blev det rapporteret, at frekvensen af T- og Callelen var henholdsvis 0,57 og 0,4319.

Vores resultater viser, at hverken de to singleplex-assays målrettet SNP rs81416363 eller duplex-assayet målrettet SNP g.299084751 C > T alene gør det muligt at skelne entydigt mellem vildsvin og tamsvin. Ved at tage resultaterne af de to singleplex-assays og duplex-assayet i betragtning kan diskriminationsevnen imidlertid øges drastisk. Vores resultater viser, at hvis de to assays for den samme underart (f.eks. assayChr9D og assayChr1D) fører til en identisk klassificering (i det givne eksempel husdyrsvin), og de resultater, der opnås med de to assays for de andre underarter (i det givne eksempel assayChr9W og assayChr1W) er tvetydige, er sandsynligheden for fejlklassificering lav, hvis man stoler på de resultater, der er identiske. Ved at følge denne strategi kunne 86 (91,5 %) ud af 94 individer klassificeres korrekt.