PMC

DET FORHåbede i forbedrede terapier gennem molekylære studier af føtal hæmoglobinregulering

Og selv om de ikke-målrettede terapeutiske tilgange, der er diskuteret ovenfor, har været lovende og har haft en vis succes med at fremkalde HbF i kliniske sammenhænge, en forbedret mekanistisk forståelse af de molekylære forudsætninger, der er nødvendige for det normale skift fra foster til voksenhæmoglobin, er meget lovende for at muliggøre udvikling af mere effektive og specifikt målrettede metoder til induktion af HbF. I årtierne efter den molekylære kloning af globin-generne blev der identificeret en række transkriptionsfaktorer, som spillede en rolle i globin-genreguleringen (Cantor og Orkin 2002). Dette omfattede transkriptionsfaktorer som GATA1, KLF1 og SCL/ TAL1. Undersøgelsen af disse faktorers rolle i globin-genregulering blev imidlertid forvirret af disse faktorers brede rolle i differentiering og deres pleiotropiske roller som regulatorer af globin- og erytroide genregulering. Ingen af disse faktorer syntes at være specifikke regulatorer af skiftet fra foster- til voksenhæmoglobin. Der gik næsten tre årtier fra den første kloning af globin-generne, før specifikke regulatorer af denne proces ville blive identificeret.

Vigtige ledetråde til identiteten af sådanne faktorer kom fra studiet af naturlig menneskelig genetisk variation. En række grupper forfulgte grundlaget for fælles genetisk variation i HbF-niveauer ved hjælp af både målrettede og genomdækkende associationsundersøgelser (GWAS) (Menzel et al. 2007; Thein et al. 2007; Lettre et al. 2008; Uda et al. 2008). Disse undersøgelser resulterede i identifikation af tre genomiske loci, der indeholder fælles varianter, som påvirker HbF-niveauerne. Dette omfattede en region på kromosom 2 inden for BCL11A-genet, en region intergenisk mellem generne HBS1L og MYB på kromosom 6 og varianter inden for β-globin-locus på kromosom 11. Nyere undersøgelser, der har kortlagt disse genetiske varianter mere detaljeret, tyder på, at >50 % af variationen i HbF-niveauer kan forklares af fælles variation på disse tre loci (Galarneau et al. 2010). Selv om HbF-niveauer menes at have en arvelig genetisk komponent i størrelsesordenen ∼80 %, er det vigtigt at huske på, at den additive genetiske variation fundet fra fælles genetiske varianter ignorerer potentielle genetiske interaktioner af højere orden, som måske ikke kan påvises, og derfor skal omfanget af HbF-niveauer, der er genetisk bestemt, stadig udforskes i fremtidige undersøgelser (Zuk et al. 2012).

Den første observation af varianter, der er forbundet med HbF-niveauer inden for zinkfinger-transskriptionsfaktoren BCL11A, førte til en indledende undersøgelse, der forfulgte hypotesen om, at BCL11A kan være en regulator af HbF-ekspression (Sankaran et al. 2008). Tidligere arbejde havde antydet, at BCL11A var en kritisk transkriptionel regulator, der var involveret i B-lymfopoiesis og neurogenese (Sankaran et al. 2010). BCL11A-proteinniveauer syntes at korrelere med udviklingsstadiet for ekspressionen, således at primitive og føtale leverdefinitive erytroide celler, der udtrykte høje niveauer af γ-globin, havde lav eller ingen ekspression af de fulde længdeformer af BCL11A. Dette resultat tyder på, at dette genprodukt fungerede som en repressor for γ-globin-generne. For direkte at teste dette blev der foretaget knockdown af BCL11A ved hjælp af short-hairpin RNA (shRNA)-metoder i primære voksne erytroide progenitors, og γ-globinekspression kunne induceres kraftigt ved en sådan knockdown. Graden af γ-globininduktion syntes at være relateret til omfanget af knockdown af BCL11A. Det er interessant, at der tilsyneladende ikke opstod større forstyrrelser i erytropoiese på trods af den robuste γ-globininduktion, der blev observeret. Opfølgningsundersøgelser har vist lignende resultater ved at slå ekspressionen af BCL11A ned ved hjælp af shRNA’er (Borg et al. 2010; Zhou et al. 2010; Wilber et al. 2011). Det blev desuden vist, at BCL11A interagerer direkte med kromatin ved det humane β-globin-lokus i primære erytroide celler, og at det syntes at fungere som en del af et kompleks med transkriptionsfaktoren GATA1 og NuRD-komplekset til kromatinremodellering og repressor-komplekset (Sankaran et al. 2008). Det er interessant, at NuRD-komplekset indeholder HDAC’er 1 og 2, som er blevet foreslået som værende de kritiske HDAC’er, der er nødvendige for HbF-silensering (Bradner et al. 2010). Desuden er det blevet foreslået, at transkriptionsfaktoren SOX6 kan samarbejde med BCL11A for at bidrage til at lukke γ-globin-generne i mennesker ned, og at den kan være afgørende for at binde den proximale promotor for disse globingener (Xu et al. 2010).

Men selv om hæmoglobinswitching i musemodeller, selv dem, der har et humant β-globin locus transgen, synes at afvige fra den normale ontogeni af globinudtryk, der ses hos mennesker, blev der vist en evolutionært bevaret rolle for BCL11A i globin-genets stilhed og switching i mus (Sankaran et al. 2009; McGrath et al. 2011). Mus, der mangler BCL11A, synes at have normal erythropoiese, men undlader at lukke de embryonale globingener i definitive erytroide celler fuldstændigt ned og tillader en vis vedvarende ekspression af γ-globin, når det intakte humane β-globinlokus er til stede. Disse resultater styrker betydningen af BCL11A som en kritisk mediator for globinskifte hos pattedyr. Selv om denne første undersøgelse omhandlede BCL11A’s rolle i udviklingsprocessen for globinskift hos mus (Sankaran et al. 2009), blev der i en nyere undersøgelse anvendt betinget inaktivering af BCL11A for at vise, at inducerbar inaktivering kan resultere i robust og lignende omfang af γ-globin-geninduktion, som det sker, når inaktivering sker på tidligere tidspunkter (Xu et al. 2011). Selv om der er differentiel regulering af globin-generne mellem mennesker og mus, blev det desuden vist, at inaktivering af BCL11A er tilstrækkelig til at forbedre de hæmatologiske og patologiske træk, der ses i musemodeller af seglcellesygdom, hvilket giver et vigtigt principielt bevis for den potentielle effektivitet af målretning af BCL11A for at inducere HbF (Xu et al. 2011).

De nøjagtige mekanismer, hvormed BCL11A dæmper γ-globin-genekspressionen, er fortsat uklare. En nylig undersøgelse tyder på, at dette kan formidles både gennem interaktioner med transkriptionsfaktorer, såsom SOX6, der binder kromatin ved de proximale γ-globinpromotorer, samt gennem langtrækkende interaktioner med en række regioner i hele β-globin-genklyngen (Xu et al. 2010). Når BCL11A er fraværende, ændres konformationen af β-globin locus således, at den opstrøms enhancer, der er kendt som locus-kontrolregionen, er placeret ved siden af de transkriptionelt aktiverede γ-globin gener. Et lignende fænomen opstår, når celler behandles med HDAC-hæmmere, der inducerer γ-globin-genekspression (Bradner et al. 2010). Det er imidlertid uklart, om disse konformationsændringer er direkte medieret af BCL11A, eller om disse ændringer opstår sekundært i forbindelse med den HbF-inducerende virkning af BCL11A- (eller HDAC-) hæmning af BCL11A. Ikke desto mindre understøtter disse resultater kraftigt den opfattelse, at BCL11A synes at have en direkte rolle i at dæmpe γ-globinekspressionen inden for β-globinlokus. Ved at kortlægge en række forskellige deletioner inden for det humane β-globin locus, der enten resulterer i δβ-thalassæmi, med beskedne stigninger i HbF og en vis resterende ubalance i globinkæden til stede, eller HPFH, med robuste stigninger i HbF og balanceret globinkædesyntese, blev det vist, at en N3-kb region opstrøms for δ-globin-genet er nødvendig for silencing af γ-globin generne (Fig. 2) (Sankaran et al. 2011c) (Sankaran et al. 2011c). Interessant nok rummer denne region bindingssteder for BCL11A sammen med dets partnere såsom GATA1 og HDAC1. Det skal bemærkes, at denne region også uafhængigt er blevet impliceret som værende vigtig for γ-globin-silensering gennem undersøgelser af Corfu thalassemia-deletionen hos mennesker (Chakalova et al. 2005). Denne undersøgelse giver vigtig mekanistisk indsigt i, hvordan BCL11A fungerer til at lukke munden på HbF og styrker betydningen af naturlige humane mutationer i forståelsen af denne udviklingsproces, der er unik for mennesker (Fig. 2) (Sankaran et al. 2011c).

I betragtning af disse fund vil BCL11A sandsynligvis være et vigtigt terapeutisk mål. Det faktum, at dets inaktivering inducerer HbF uden at resultere i en større forstyrrelse i erythropoiese, er meget lovende, selv om det vides at have vigtige virkninger i andre lineager såsom B-lymfocytter, hvilket understreger vigtigheden af in vivo-modellering og -analyse som led i de igangværende bestræbelser på at målrette BCL11A til HbF-induktion. Yderligere undersøgelser, der udforsker de virkningsmekanismer, hvormed BCL11A fungerer, kunne føre til bedre og mere specifikt målrettede tilgange til HbF-induktion (Sankaran et al. 2011c). SOX6 kan også være et potentielt lovende mål for HbF-induktion (Xu et al. 2010), selv om det er kendt for at være nødvendigt for normal erythropoiese (Dumitriu et al. 2006). Der er imidlertid blevet rapporteret om en patient med en heterozygot forstyrrelse af SOX6, som ikke havde forhøjede HbF-niveauer, hvilket tyder på, at SOX6-genet kan have en mekanisme til dosiskompensation, eller at der kan være en særlig tærskel, der er nødvendig for at reducere ekspressionen af dette gen for at få robust HbF-induktion (Sankaran et al. 2011a). Dette tyder på, at der kan være begrænsninger i at betragte SOX6 som et potentielt mål for HbF-induktion.

I forlængelse af de indledende undersøgelser af BCL11A foreslog to undersøgelser, at ekspressionen af BCL11A synes at blive kontrolleret af den erytroide specifikke transkriptionsfaktor KLF1 ved hjælp af uafhængige og komplementære tilgange. I den ene undersøgelse resulterede en mus med en hypomorphisk allel af KLF1 i forhøjelser af embryonalt globinudtryk, og transgene mus med det humane β-globinlokus viste vedvarende udtryk af γ-globin (Zhou et al. 2010). Som følge heraf testede forskerne, om den samme regulering kunne forekomme i primære menneskelige erytroide celler og kunne vise en lignende forbindelse ved hjælp af shRNA-tilgange. Forskerne viste derefter, at denne effekt opstår både gennem direkte virkninger af KLF1 ved β-globin locus, men også via indirekte virkninger formidlet gennem reduceret ekspression af BCL11A ved KLF1 knockdown. Dette resultat viste, at KLF1 var en direkte positiv transkriptionel regulator af BCL11A-ekspression. En anden gruppe undersøgte det genetiske grundlag for en ikke-linked form for HPFH, som blev foreslået som følge af en KLF1-missense-mutation i denne familie (Borg et al. 2010). Forskerne kunne ved hjælp af primære celler fra disse patienter og fra upåvirkede kontroller vise, at den konstaterede effekt til dels kunne tilskrives en silencerende effekt af KLF1 på BCL11A. Et område med fortsat usikkerhed vedrører de humane fænotyper, der ses i forbindelse med forskellige tilfælde af KLF1-mutationer. Selv om alle modtagere af missense-mutationen i den oprindelige rapport havde forhøjelser af HbF-ekspressionen, skal det bemærkes, at denne faktisk varierede mellem 3 % og 19 % af det samlede hæmoglobinniveau. Desuden viser andre rapporter om heterozygote KLF1-mutationer hos mennesker enten en samtidig forstyrrelse af erytropoiese eller en ringe effekt på HbF-ekspressionen (Arnaud et al. 2010; Satta et al. 2011). Nyere undersøgelser tyder på, at sjældne varianter i KLF1 faktisk er forbundet med forhøjelser i HbF, men dette synes ikke at forekomme konsekvent eller i samme omfang, selv med lignende mutationer (Gallienne et al. 2012). Grundlaget for denne variation skal stadig bestemmes og vil være vigtigt for bedre at forstå de mekanismer, hvormed KLF1 virker både direkte og indirekte, for at påvirke HbF-ekspressionen. Dette vil være afgørende for ethvert fremtidigt arbejde, der forsøger at målrette KLF1 for HbF-induktion, især hvis de uheldige virkninger af en sådan hæmning på erytroide differentiering skal undgås. I betragtning af KLF1’s specificitet inden for den erytroide slægt og hvis KLF1’s globin-genregulerende aktivitet kunne målrettes specifikt, bør det dog stadig betragtes som en kandidat til induktion af HbF.

Ud over de almindelige genetiske varianter, der er identificeret i BCL11A, som er forbundet med HbF-niveauer hos mennesker, viste GWAS-undersøgelserne, at der var varianter på kromosom 6 intergenisk mellem generne HBS1L og MYB, som synes at have en dramatisk effekt på HbF-niveauerne hos mennesker (Menzel et al. 2007; Thein et al. 2007; Lettre et al. 2008; Uda et al. 2008). Det er vigtigt at forstå den virkningsmekanisme, hvormed disse varianter resulterer i ændringer i HbF-niveauet, da de genetiske varianter på dette locus synes at have lige så stor eller måske endda større effekt på den kliniske morbiditet i β-hæmoglobinopatierne som varianterne på BCL11A-lokusset (Galanello et al. 2009; Nuinoon et al. 2010). Interessant nok indeholder denne region en række reguleringselementer, der er blevet foreslået at spille en vigtig rolle i reguleringen af ekspressionen af MYB i erytroide progenitors (Mukai et al. 2006; Wahlberg et al. 2009; Stadhouders et al. 2011). Selv om overekspression af HBS1L ikke syntes at påvirke γ-globinekspressionen i K562 erythroleukæmiceller, syntes overekspression af MYB at påvirke niveauet af γ-globin produceret i disse celler (Jiang et al. 2006). Desuden havde kulturer af primære erytroide progenitorer fra mennesker med højere ekspression af HbF oftere nedsat ekspression af MYB (Jiang et al. 2006).

Der er ved at følge op på den klassiske kliniske observation, at patienter med en trisomi af kromosom 13 har et forsinket skift fra foster til voksen hæmoglobin og fortsat har vedvarende ekspression af HbF (Huehns et al. 1964; Sankaran og Sapp 2012), har nyere undersøgelser givet yderligere beviser for en rolle for MYB i reguleringen af HbF-ekspression. Ved fin kortlægning og udførelse af integrativ genomisk analyse af gener i et område på kromosom 13, der er impliceret som værende nødvendigt for den forhøjelse af HbF, der ses hos patienter med partielle trisomier på kromosom 13, blev det fundet, at der var to små ∼22 nukleotid-RNA-molekyler, der var topkandidater til at udføre en sådan aktivitet, microRNA’er 15a og 16-1 (Sankaran et al. 2011b). Overekspression af disse microRNA’er i primære voksne erytroide celler i kultur resulterede i stigninger i γ-globinproduktionen. Ved at undersøge målene for disse microRNA’er blev det bemærket, at et af de vigtigste mål i erytroide celler var MYB. Direkte knockdown af MYB i primære voksne erytroide progenitors resulterede i dramatiske stigninger i γ-globinproduktionen (Sankaran et al. 2011b), hvilket forbinder denne historiske observation fra et sjældent humant aneuploidiesyndrom med det nyere arbejde, der undersøger molekylære mekanismer, der regulerer HbF-niveauerne.

Mekanismen, hvormed MYB kan virke til at regulere HbF-niveauerne, er stadig uklar. Dette kan skyldes en effekt på kinetikken af erythropoiese eller alternativt kan det også ske som følge af en direkte effekt inden for β-globin locus (Higgs og Wood 2008). Yderligere arbejde vil være nødvendigt for at udforske sådanne mekanismer og er meget lovende i forsøg på terapeutisk at målrette dette molekyle til HbF-induktion. Der er bekymring for, at målretning af MYB kan have uønskede bivirkninger, især i betragtning af MYB’s plejotrope rolle i hæmatopoiesen (Emambokus et al. 2003; Carpinelli et al. 2004). Nyere arbejde tyder imidlertid på, at sådanne strategier faktisk kan være lovende, fordi delvis knockdown af Myb i mus havde lille effekt på normal in vivo hæmatopoiese, mens den dramatisk blokerede progression af leukæmier (Zuber et al. 2011a). Derfor kan delvis inhibering af MYB være lovende som en værdifuld strategi for HbF-induktion. Den additivitet af virkningerne af varianter i den intergene HBS1L-MYB-region sammen med varianter på BCL11A-lokusset (Lettre et al. 2008; Galanello et al. 2009; Nuinoon et al. 2010) tyder på, at målretning af begge disse veje sammen kunne give endnu mere robuste virkninger end målretning af en af vejene alene.

Og selv om de regulatorer af HbF-regulering, der er diskuteret ovenfor, er blevet fundet gennem humangenetiske undersøgelser, hvilket bekræfter deres in vivo relevans hos mennesker, er en række andre molekyler også blevet foreslået at spille en rolle i γ-globin-genregulering gennem forskellige undersøgelser ved hjælp af cellekulturtilgange eller med musemodeller (tabel 1). Disse molekyler vil blive diskuteret nedenfor. Det er vigtigt at huske på, at der er begrænsninger for de fleste af de nuværende eksperimentelle systemer, der anvendes til at studere γ-globin-genregulering. Primære humane erytroide celler synes at være tolerante over for manipulationer, der giver mulighed for at øge γ-globinproduktionen, hvilket måske ikke altid er relevant hos mennesker in vivo. Desuden fungerer mange af de stimuli, der er kendt for at inducere γ-globinproduktion in vivo hos mennesker, herunder forskellige typer af stress-erytropoiese og behandling med hydroxyurea, ikke til at inducere γ-globinproduktion i humaniserede musemodeller (Pace et al. 1994; Sankaran et al. 2009), hvilket understreger en vigtig begrænsning for fortolkning af negative resultater i dette eksperimentelle system. Der skal således udvises forsigtighed ved fortolkning af eksperimentelle resultater, der ikke understøttes af beviser fra humangenetiske undersøgelser eller undersøgelser udført på mennesker eller primater in vivo.

Ved at undersøge proteiner, der binder de direkte gentagelseselementer, der findes i promoteren af γ-globin-generne, er de forældreløse kernehormonreceptorer TR2 og TR4 blevet foreslået at spille en rolle som repressorer af ekspressionen af γ-globin-generne (Tanabe et al. 2002, 2007; Cui et al. 2011). Paradoksalt nok resulterer overekspression af TR2 og TR4 i transgene musemodeller i forhøjet ekspression af γ-globin, og når de overeksprimeres i musemodeller for seglcellesygdom, kan det resultere i en delvis forbedring af de hæmatologiske og patologiske symptomer hos disse mus (Campbell et al. 2011). De mekanismer, der ligger til grund for disse observationer, og relevansen for regulering af globin-genet hos mennesker mangler stadig at blive fastlagt for TR2 og TR4. Desuden er det også blevet foreslået, at det forældreløse kernehormon nukleare receptor COUP-TFII binder sig til de direkte gentagelser og undertrykker γ-globinpromotoren hos mennesker (Filipe et al. 1999). Ved hjælp af in vitro-kulturer af primære voksne erytroide celler blev det vist, at cytokiner som SCF synes at nedregulere ekspression og kromatinbelægning af COUP-TFII ved β-globin-lokus, hvilket resulterer i øget γ-globinekspression (Aerbajinai et al. 2009). Desuden kan direkte nedregulering af COUP-TFII ved hjælp af små interfererende RNA’er (siRNA’er) resultere i en stigning i γ-globinproduktionen (Aerbajinai et al. 2009). Der vil være behov for yderligere undersøgelser af COUP-TF’s rolle i reguleringen af HbF for bedre at forstå dens fysiologiske rolle hos mennesker.

Nyere undersøgelser har også antydet en rolle for genet kaldet friend of PRMT1 (FOP1) i repression af γ-globin-genekspression (van Dijk et al. 2010). Knockdown af FOP1 resulterer i forhøjet HbF-ekspression i humane voksne erytroide celler i kultur. Det blev foreslået, at dette blev formidlet gennem reduceret ekspression af SOX6, hvis knockdown også vides at resultere i øget γ-globinproduktion (Xu et al. 2010). Yderligere arbejde vil være nødvendigt for at bekræfte disse fund, forstå, om dette gen også har en rolle i erytropoiese mere generelt, og undersøge den mekanisme, der ligger til grund for disse observationer.

Nogle undersøgelser har også foreslået en rolle for stadie-selektorproteinet NF-E4 som en aktivator for γ-globinekspression hos mennesker (Jane et al. 1995; Zhao et al. 2006). Det er blevet foreslået, at en kort form af NF-E4 kan spille en rolle i undertrykkelsen af γ-globin-generne ved at hæmme den normale aktiverende funktion af NF-E4 ved promotoren af disse gener (Zhou et al. 2004). Disse undersøgelser har alle været baseret på forsøg udført i dyrkede celler og biokemisk oprensning af proteinkomplekser fra K562-celler, og der vil derfor være behov for yderligere arbejde for at bekræfte den fysiologiske rolle af dette gen i γ-globinekspression og bedre forstå de mekanismer, hvorigennem dette kompleks kan virke for at ændre reguleringen af humane globin-gener.