Materialien und Methoden
Duplex-DNA-Vorbereitung. Um die 30-bp-Duplex-DNA-Moleküle herzustellen, wurden zwei Oligonukleotide mit der folgenden Sequenz und den folgenden Modifikationen hybridisiert (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Das Oligonukleotid 5′-GGGTATGGAGATTTTTAGCGGAGTGACAGC-3′ wurde an seinem 5′-Ende mit Cy5 und an seinem 3′-Ende mit Cy3 markiert. Das komplementäre Oligonukleotid war an beiden Enden mit Biotin markiert.
Proteinexpression und -aufreinigung. Das gelb fluoreszierende Protein (YFP)-Gen im p2Bac/pFastBac-YFP-M5-CaM-Plasmid (ein Geschenk von H. Lee Sweeney, University of Pennsylvania, Philadelphia) wurde durch PCR entfernt. Das resultierende p2Bac/pFastBac-M5-CaM-Plasmid kodiert für Hühner-Myosin V, das an Glu-1099 verkürzt ist. Nach der nativen Coiled Coil folgt ein Leucin-Reißverschluss, um die Dimerisierung zu gewährleisten. Um die Reinigung zu erleichtern, wurde das Myosin-V-Protein N-terminal mit einem FLAG-Tag (DYKDDDDK) markiert. Für die Proteinexpression in Sf9-Zellen wurden zwei rekombinante Baculoviren hergestellt. Eines kodierte das verkürzte Myosin V und das Calmodulin von Drosophila melanogaster, das vom p2Bac/pFastBac-M5-CaM-Plasmid abgeleitet wurde. Das zweite Virus kodierte die menschliche essentielle leichte Kette, die vom p2Bac/pFastBac-ELC-Plasmid abgeleitet war. Beide Viren wurden für die Koinfektion von Sf9-Zellen verwendet. Das Protein wurde wie von Sweeney et al. (20) beschrieben exprimiert und gereinigt.
Calmodulin Markierung und Austausch. Calmodulin wurde wie folgt exprimiert und mit Cy3 oder Cy5 markiert: In Seeigel-Calmodulin wurde durch die Mutation Q143C ein einzelnes Cystein eingeführt. Dieses Calmodulin wurde in Escherichia coli exprimiert und wie in Ref. 21 beschrieben gereinigt. Das Calmodulin wurde entweder mit Cy3-Maleimid oder Cy5-Maleimid (Amersham Biosciences) Stammlösungen (in DMSO) in einem 1,4-fachen molaren Verhältnis für 20 Minuten markiert. Überschüssiger Farbstoff wurde durch Gelfiltration in Austauschpuffer (siehe unten) entfernt, gefolgt von hydrophober Absorption über Nacht auf BioBeads (Bio-Rad). Der Markierungseinbau betrug 102 % für Cy3-Calmodulin und 75 % für Cy5-Calmodulin. Aliquots wurden bei -80°C gelagert.
Der Austausch von markiertem Calmodulin auf Myosin V wurde wie beschrieben durchgeführt, jedoch mit einigen Änderungen (22). Myosin V (150 nM) wurde mit 0,7 nM Cy3-markiertem Calmodulin und 0,8 nM Cy5-markiertem Calmodulin in Austauschpuffer (25 mM KCl/20 mM Imidazol HCl, pH 7,4/2 mM MgCl2/1 mM EGTA) bei 22°C für 2 min inkubiert. Zum Austausch von Calmodulinen wurden 0,9 mM CaCl2 zugegeben und die Mischung 5 Minuten bei 22°C inkubiert. Die Reaktion wurde mit 7 mM EGTA gequencht. Die Reaktionsmischung wurde auf ein 100K MWCO Nanocep Ultrafiltrationsgerät (Pall) aufgetragen und dreimal mit gleichen Volumina AB (unten) gewaschen, um Myosin V von überschüssigem Calmodulin zu reinigen.
Vorbereitung der Durchflusszelle. Die Fließzelle wurde mit einem Glasmikroskop-Objektträger und hochbrechenden Deckgläsern aus NLAF21 (VA Optical Labs, San Anselmo, CA) konstruiert, die mit Stücken von doppelseitigem Klebeband zusammengehalten wurden.
Für die Myosin-V-Experimente wurden 15 μl Biotin-BSA (1 mg-ml-1) 2 Minuten lang in der Durchflusszelle inkubiert, danach wurden 30 μl AB-Puffer (25 mM KCl/25 mM Imidazol HCl, pH 7,4/1 mM EGTA/4 mM MgCl2/10 mM DTT/1 mg-ml-1 BSA) durch die Durchflusszelle geleitet, um sie auszuwaschen. Fünfzehn Mikroliter 0,5 mg/ml NeutrAvidin (Molecular Probes) wurden in die Zelle gegeben und 2 Minuten lang inkubiert, wonach ein weiterer Waschvorgang mit AB-Puffer durchgeführt wurde. Die Fließzelle wurde 5 Minuten lang mit 15 μl biotinylierten Phalloidin-Actin-Filamenten (250 nM) inkubiert, gefolgt von einem 100-μl-Waschgang mit AB-Puffer. Schließlich wurde die Zelle mit 20 μl Bildgebungspuffer beladen, der Calmodulin-ausgetauschtes Myosin V, 5 μM Calmodulin, 300 nM ATP, ein ATP-Regenerationssystem (0,1 mg-ml-1 Kreatinphosphokinase/1 mM Kreatinphosphat) und 0,5 % (Vol./Vol.) Triton-X 100 zur Verringerung unspezifischer Bindungen enthielt. Die Zelle wurde mit Vakuumfett versiegelt und sofort abgebildet. Die endgültige Motorkonzentration führte zu spärlich dekoriertem Aktin und ermöglichte somit die Analyse einzelner Myosin-V-Moleküle.
Für die DNA-Experimente wurden Biotin-BSA und NeutrAvidin auf die gleiche Weise wie für die Myosin-V-Experimente geladen, aber die Waschungen erfolgten mit T50-Puffer (10 mM Tris, pH 8,0/50 mM NaCl). Sobald die Fließzelle mit NeutrAvidin beschichtet war, wurden 15 μl dsDNA (30 nM) in T50-Puffer mit 1 mg-ml-1 BSA eingefüllt und 2 Minuten lang inkubiert, wonach 100 μl Imaging-Puffer eingefüllt wurden. Die Fließzelle wurde dann mit Vakuumfett versiegelt und sofort abgebildet. Die resultierende Dekoration der DNA-Moleküle auf der Oberfläche war so spärlich, dass sich die fluoreszierenden Flecken verschiedener Moleküle kaum überlappten.
Mikroskopaufbau. Das Fluoreszenzmikroskop mit totaler interner Reflexion (TIRF) wurde wie in Ref. 8, mit einigen Änderungen (Abb. 5, die als unterstützende Information auf der PNAS-Website veröffentlicht ist). Die Strahlen der Anregungsquellen bei 532 nm (Coherent, Santa Clara, CA) und 633 nm (JDS Uniphase, San Jose, CA) wurden durch einen dichroitischen Spiegel kombiniert und auf einen Durchmesser von 7 mm erweitert. Diese Quellen wurden auf die hintere Brennebene eines Olympus 1,65 NA ×100 TIRF-Objektivs fokussiert (Brennweite = 500 mm), und zwar mit Hilfe eines Laserlinien-Dichroitikums auf einer linearen DeepL Translation, die den Betrieb des Mikroskops entweder im Epifluoreszenz- oder im TIRF-Modus ermöglicht. Das Objektiv wurde unter einer zweiachsigen Piezo-NanoDeepL-Translation mit geschlossenem Regelkreis positioniert, die mit kapazitiven Sensoren zur Positionsmessung ausgestattet ist (Physik Instrumente, Auburn, MA). Das reflektierte Licht, das aus der hinteren Öffnung des Objektivs austrat, wurde auf eine Quadranten-Photodiode gerichtet, um ein Signal für eine Fokus-Rückkopplungsschleife zu liefern, die den Abstand zwischen Objektiv und Probe mit einem elektrostriktiven Aktuator (Newport, Fountain Valley, CA) festlegte. Die Fluoreszenzemission wurde vom Objektiv aufgefangen, durch zwei StopLine-Dünnfilm-Kerbfilter (Semrock, Rochester, NY) geleitet, einen für jede Anregungsquelle, und durch eine Dual-View-Apparatur übertragen, die die gleichzeitige Abbildung der Cy3- und Cy5-Kanäle auf einer einzigen iXon DV 887 EMCCD-Kamera (Andor Technology, Belfast, Irland) ermöglichte. Alle Daten wurden mit einer Integrationszeit von 0,5 Sekunden aufgenommen. Durch das Übersprechen zwischen den beiden Kanälen (10 %) werden die Entfernungsmessungen vermutlich zu kleineren Werten verzerrt. Unser experimenteller Fehler ist jedoch nicht nachweisbar, wie Monte-Carlo-Simulationen zeigen, bei denen 100 Paare von modellierten Bildern einzelner Fluorophore mit einem Abstand von 10 nm erstellt und wie bei den DNA-Daten analysiert wurden (siehe unten). Simulierte Bilder von Fluoreszenz-Punktspreizungsfunktionen wurden berechnet, indem eine integrierte 2D-Gauß-Intensitätsverteilung mit einem konstanten Hintergrund erzeugt wurde, zu dem Schussrauschen hinzugefügt wurde. Die simulierten Peaks hatten die gleichen Abmessungen und das gleiche Signal-Rausch-Verhältnis wie die realen Peaks. Simulierte Daten mit 10 % Crosstalk und simulierte Daten ohne Crosstalk sind durch einen Kolmogorov-Smirnov-Test nicht unterscheidbar (N 1 = 100, N 2 = 100, p > 0,05).
Datenanalyse. Ein Registrierungsmapping der Cy3- und Cy5-Kanäle wurde mit Fiducials durchgeführt, die aus 100-nm-TransFluoSphere-Beads (Molecular Probes) bestanden. Sie wurden bei 532 nm angeregt und emittieren mit einem breiten Emissionsspektrum. Das Bead war in beiden unserer Kanäle nachweisbar. Wir platzierten ein einzelnes Bead in Verbindung mit dem Deckglas und bewegten es mit unserem Piezotisch mit Nanometerpräzision in einem Rastermuster (mit einem Abstand von 0,5 μm), wobei wir bei jedem Stopp ein Bild aufnahmen. Das Endergebnis war ein Stapel von 312 Bildern, der das Kügelchen in beiden Kanälen an verschiedenen Positionen zeigt (Abb. 1a ).
Die DNA-Daten wurden mit selbst entwickelter Software unter Verwendung von Matlab (Mathworks, Natick, MA) analysiert. Die Routine lokalisiert automatisch Peaks im Bild, indem sie die Pixel mit hoher Intensität bestimmt und sicherstellt, dass die umgebenden Pixel die für ein einzelnes Fluorophor erwarteten Intensitäten aufweisen. Bevor die Peaks an eine 2D-Gauß-Funktion angepasst werden, um ihre Mittelpunkte zu ermitteln, wird nach Peakpaaren gesucht. Die im Cy5-Kanal gefundenen Pixel werden auf den Cy3-Kanal abgebildet, und es wird nach Peaks in den umgebenden Cy3-Pixeln gesucht. Wenn ein Peak gefunden wird, werden der Cy5-Peak und der Cy3-Peak für die weitere Analyse als Paar betrachtet. Jeder Peak wird an eine 2D-Gauß-Funktion in seinem jeweiligen Raum angepasst, wie oben für die Beads beschrieben (Gl. 1). Der Fehler in Bezug auf die mittlere Lage des Fits wird mit der Anzahl der gesammelten Photonen (Nγ) berechnet. 
Die Lage des Cy5-Peaks wird auf den Cy3-Kanal abgebildet, und der Abstand zwischen ihnen wird berechnet. Nach der computergestützten Analyse der DNA-Daten wurden die identifizierten Fluorophorpaare manuell überprüft, um sicherzustellen, dass die Paare nicht in der Nähe anderer Fluorophore lagen, die die Analyse der Paare gestört hätten.
Die Myosin-V-Daten wurden analysiert, indem zunächst ein sich bewegender Motor mit dem Auge identifiziert wurde. Eine in Matlab geschriebene Software passte dann das Ausgangspaar der Fluoreszenzpeaks an 2D-Gauß-Funktionen an, wie oben beschrieben, und verfolgte die Peaks so lange, wie vom Benutzer angegeben. Es wurden Motoren analysiert, deren konjugierte Farbstoffe jeweils in einem einzigen Schritt photobleachen, was bei den meisten der beobachteten Motoren der Fall war, was sicherstellte, dass wir tatsächlich Motoren mit nur einer Cy3- und einer Cy5-Markierung untersuchten. Die resultierenden Trajektorien wurden registriert, indem die Cy5-Trajektorie auf den Cy3-Kanal abgebildet wurde. Eine lineare Anpassung nach der Methode der kleinsten Quadrate an die Punkte aus beiden Trajektorien ergab die Orientierung des Aktinfilaments, auf das die Trajektorien projiziert wurden. Die Abstände entlang der linearen Anpassung (das Aktinfilament) wurden gegen die Zeit aufgetragen, um die relativen Abstände der Köpfe zu sehen (Abb. 4).
Zeitspur eines unterschiedlich markierten Myosin-V-Moleküls, das entlang eines Aktinfilaments läuft. Die Markierungen (Cy3 und Cy5) sind kovalent an Calmoduline gebunden, die auf dem Myosin-V-Molekül ausgetauscht wurden. In dieser Spur bewegen sich beide Fluoreszenzsonden in 72-nm-Schritten, was darauf hindeutet, dass die Calmoduline in der Nähe der Motordomäne ausgetauscht wurden. Die abwechselnden Positionen der Sonden ermöglichen eine direkte Beobachtung des Hand-zu-Hand-Geh-Mechanismus von Myosin V.