Pathogenese in vitro
Kolumnare Epithelzellen sind Sackgassenzellen, die zwei extreme pH-Werte auf einmal erfahren. Apikal sind sie in stark alkalischen Darmflüssigkeiten und basal in leicht saurer Hämolymphe gebadet. Diese Bedingungen lassen sich in Zellkulturen nur schwer nachahmen, was der Grund dafür sein könnte, dass nur wenige Informationen über Primärinfektionen vorliegen.
Zelllinien, die die Replikation von GV unterstützen, sind selten und existieren derzeit nur für CpGV. Daher wissen wir wenig mehr über die Mechanismen der GV-Infektion als über die ODV-Infektion. Dennoch wissen wir, dass während der Morphogenese des GV-Nukleokapsids die Kernmembran der Wirtszelle zerfällt, ein Vorgang, der die Nukleokapsidverarbeitung nicht unterbricht. Das Verschwinden der Kernmembran ist unverwechselbar und kommt in NPV-infizierten Wirtszellen nicht vor.
Eine Reihe von Insektenzelllinien wurde etabliert, die NPV-Infektionen unterstützen. Die meisten dieser Zelllinien stammen von Raupen-Ovarien oder Embryonen. AcMNPV kann sich in Zelllinien replizieren, die von verschiedenen Insektenarten stammen, was dazu beiträgt, dass es das am besten untersuchte Baculovirus ist. In einer standardmäßigen einstufigen Wachstumskurve werden AcMNPV-BVs typischerweise 12-20 Stunden nach der Infektion (hpi) und Okklusionen 20-48 hpi produziert. Die Replikation der meisten anderen NPVs in Zellkulturen dauert Stunden bis Tage länger.
AcMNPV BV ist 1000-mal infektiöser als ODV, was hauptsächlich auf das Vorhandensein seines Fusionsproteins GP64 zurückzuführen ist. BVs gelangen durch Clathrin-vermittelte Endozytose in ihre Zielzellen. BV-Nukleokapsiden dringen tief in das Zytoplasma der Zielzellen ein, indem sie aus Endosomen freigesetzt werden. Mit dieser Strategie umgehen die Nukleokapsiden die möglicherweise gefährliche Umgebung, die direkt unter der Plasmamembran liegt, und gelangen näher an den Zellkern, als es die Fusion an der Plasmamembran erlauben würde. Die pH-sensitiven Konformationsverschiebungen der BV-Fusionsproteine dienen dazu, ein Fusionsereignis zwischen der Virushülle und der endosomalen Membran auszulösen.
AcMNPV-Nukleokapside verlassen das Endosom unmittelbar nach ihrer Assoziation mit F-Actin-Kabeln. Die Kabelbildung ist vorübergehend und erfolgt während der Zeit, in der sich virale Nukleokapside zum Kern bewegen und in diesen eintreten. Während des Transits kolokalisieren virale Nukleokapsiden mit einem Ende eines Aktinkabels, möglicherweise über P78/83, ein F-Aktin-bindendes Protein, von dem angenommen wird, dass es sich an der Basis der Nukleokapsiden befindet. Die Assoziation von Nukleokapsiden mit F-Aktin-Kabeln und die Verzögerung der Expression von Reportergenen in Gegenwart von Medikamenten, die die Aktin/Myosin-Funktion stören, legen nahe, dass die Kabel den Transport von Nukleokapsiden in den Zellkern erleichtern oder ihre Passage durch Kernporen vermitteln können.
NPV und einige GV-Nukleokapside gelangen über Kernporen in den Zellkern. Einige GVs entschichten sich an den Kernporen, aber die meisten Baculoviren entschichten sich innerhalb des Kerns. Die frühe Gentranskription beginnt sofort und wird durch die Wirts-RNA-Polymerase II (Pol II) vermittelt. Unter den frühen Genen, die exprimiert werden, gibt es eine Untergruppe, deren Expression zu einem effizienten G-Actin-Transport in den Kern und zu einer Anhäufung innerhalb des Kerns führt (Abbildung 5). Diese spektakuläre Manipulation der Aktinlokalisierung ist entscheidend für die Produktion von NPV-Nachkommen und wurde bisher für kein anderes Pathogen beschrieben. Zu den Genen, die an der nukleären Lokalisierung von Aktin beteiligt sind und in transienten Transfektionsexperimenten identifiziert wurden, gehören ie1, pe38, Ac004, Ac152, he65 und Ac102. Zwei der Gene, ie1 und Ac102, sind bei allen Lepidoptera NPVs und GVs konserviert, und beide sind essentiell.
Abbildung 5. Nukleäres G-Actin in AcMNPV-infizierten Zellen. (a) 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-gefärbte infizierte Zellen; (b) infizierte Zelle, die transfiziertes grün fluoreszierendes Protein (GFP)-Actin exprimiert. (c) Das Fehlen einer Rhodamin-Phalloidin-Färbung des Zellkerns deutet darauf hin, dass das nukleäre Aktin monomer ist.
Der Übergang zum späten Stadium der Infektion ist der Beginn der BV-Nachkommenschaftsproduktion; die zellulären Aktivitäten sind darauf ausgerichtet, virale Komponenten mit maximaler Geschwindigkeit zu synthetisieren, sie zu Nukleokapsidprodukten zusammenzusetzen und sie dann zu exportieren. Die makromolekulare Synthese des Wirts wird in dieser Zeit heruntergefahren, aber die Chromatinstruktur des Wirts bleibt bis zum Zelltod intakt. Späte und sehr späte virale Gene werden durch eine vom Virus kodierte RNA-Polymerase exprimiert.
Mikrotubuli, die während der frühen Phase der Infektion reorganisiert werden, werden durch Faktoren, die während der späten Phase produziert werden, depolymerisiert, was zur Zellrundung führt (Abbildung 6). In ähnlicher Weise polymerisiert G-Actin, das in der frühen Phase im Zellkern akkumuliert wurde, in der späten Phase, was mit einer Schwellung des Zellkerns und dem Verschwinden der sichtbaren Kernstrukturen des Wirts einhergeht (Abbildung 7). Das virogene Stroma, der Ort der viralen DNA-Synthese, bildet sich in der Mitte des Kerns und ist von einer elektronenluziden Zone, der so genannten „Ringzone“, durchsetzt und umgeben, einem Ort, an dem die Kapside während der Genomladung zusammengebaut und befestigt werden. F-Actin im Zellkern ist mit dem wichtigsten AcMNPV-Kapsidprotein in der Ringzone kolokalisiert (Abbildung 7).
Abbildung 6. AcMNPV-infizierte Sf21-Zellen, die verschiedene Phasen des zytopathischen Effekts (CPE) zeigen. (a) Uninfizierte Zellen. Man beachte die Spindelform und das Vorhandensein von Nukleochromatinstrukturen. (b) AcMNPV-infizierte Zellen mit frühem und spätem CPE. Die Zellen sind aufgrund der depolymerisierenden Mikrotubuli abgerundet, die Zellkerne sind größer und von Wirtsstrukturen befreit, und das virogene Stroma (vs) ist von einer Ringzone (rz) umgeben. Das virogene Stroma wird in der Spätphase der Infektion immer dichter. Polyeder füllen den Zellkern im sehr späten Stadium der Infektion (p).
Abbildung 7. Nukleäres F-Actin in AcMNPV-infizierten Zellen während der späten Genexpression. (a) DAPI-Färbung zeigt die Lage des Zellkerns an. (b) Die grüne Fluoreszenz zeigt an, dass das Kapsidprotein hauptsächlich in der Ringzone des Zellkerns lokalisiert ist. (c) Die Rhodamin-Phalloidin-Färbung zeigt, dass F-Actin mit dem Capsid in der Ringzone kolokalisiert ist.
F-Actin im Zellkern ist für die BV-Produktion erforderlich. In Gegenwart von F-Aktin-unterbrechenden Medikamenten sind die viralen Kapside missgebildet und erscheinen als lange röhrenförmige Strukturen, die an die innere Kernmembran angrenzen, mit seltenen Flecken aus elektronendichtem Material. Die normalerweise vorhandenen Grundplatten und Kappenstrukturen sind nicht erkennbar, und es wird ein Überschuss an membranösen Profilen produziert. Die virale DNA-Synthese erfolgt mit normaler Geschwindigkeit, aber die Genome werden nicht verpackt, und das virogene Stroma hat im Vergleich zum normalen Stroma ein „entspanntes“ Aussehen. Interessanterweise ist der Phänotyp bei Abwesenheit von AcMNPV very late factor-1 (VLF-1) ähnlich, was darauf hindeutet, dass VLF-1 an der Bindung von Kapsiden an das virogene Stroma beteiligt sein könnte und dass F-Actin eine Komponente des Stromas ist, an die Kapside direkt oder indirekt gebunden werden.
P78/83, ein kleines Kapsidprotein, das spät während der Infektion exprimiert wird, ist für die Lebensfähigkeit von AcMNPV wesentlich. Diese Eigenschaft wurde vor über 30 Jahren entdeckt und in den ersten kommerziellen Baculovirus-Expressionskits genutzt. Es wird angenommen, dass P78/83 (78 kDa, wenn es nicht phosphoryliert ist, und 83 kDa, wenn es phosphoryliert ist) Teil der Basisplatten der BV- und ODV-Kapside ist. P78/83 ist ein F-Actin-bindendes Protein, und diese Aktivität könnte dazu beitragen, die Kapsiden während des Zusammenbaus an die Kernmatrix zu binden. Interessanterweise verfügt P78/83 über eine weitere Aktivität, die erklärt, warum es essenziell ist: Es fördert die Aktinpolymerisation innerhalb des Zellkerns. P78/83 enthält Domänen, die in Mitgliedern der Wiskott-Aldrich-Syndrom-Proteinfamilie (WASP) konserviert sind, Faktoren, die die Nukleation von Aktinfilamenten fördern. Mitglieder der WASP-Familie regulieren positiv die Aktin-Kernbildungsaktivität des Actin Related Protein (Arp)-2/3-Komplexes. Der aus sieben Untereinheiten bestehende Komplex, der in allen Eukaryonten konserviert ist, wird in AcMNPV-infizierten Zellen in den Zellkern verlagert und durch P78/83 aktiviert. Mutationen in P78/83, die zu einer verminderten Fähigkeit zur Förderung der Aktin-Nukleation führen, führen entsprechend zu einer verminderten Fähigkeit, infektiöses BV zu produzieren.
Unmittelbar nach dem Eintritt in den Zellkern nimmt die AcMNPV-DNA eine nukleosomenähnliche Struktur an und nutzt Nukleosomen und mit Nukleosomen verbundene Prozesse bei der Genomreplikation. Eine Komponente der viralen Replikationsstrategie scheint daher darin zu bestehen, Komponenten, wenn nicht sogar die gesamte Kapazität zur Umgestaltung des Wirtschromatins zu kapern. Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die Proteine der BRO-Familie (Baculovirus repeated orf) wahrscheinlich an diesem Prozess beteiligt sind. Die BRO-Proteine werden früh während der Infektion exprimiert, binden einzelsträngige DNA (ssDNA) und Kernhistone und teilen sich in Fraktionierungsexperimenten mit Histonen. BmNPV, das multiple Nukleopolyhedrovirus von Orgyia pseudotsugata und das multiple Nukleopolyhedrovirus von Lymantria dispar besitzen alle mehrere BRO-Gene. AcMNPV trägt nur ein bro-Gen, das mit dem bro-d-Gen von BmNPV verwandt und essentiell ist.
Das von AcMNPV kodierte P6.9, das hochgradig basische Genomverpackungsprotein, beginnt sich in der Spätphase der Infektion zu akkumulieren, und es entsteht eine alternative Chromatinstruktur.
Die P6.9-DNA-Interaktionen werden durch den Phosphorylierungszustand von P6.9 gesteuert. Während der Genomverpackung bindet die genomische DNA aus dem virogenen Stroma an P6.9, wenn P6.9 dephosphoryliert ist, und kondensiert durch eine Öffnung in einer konischen Endstruktur zu einer vorgeformten Kapsidhülle. Die konischen Strukturen liegen proximal zum virogenen Stroma, wobei die Kapsidhüllen von Basisplatten bedeckt sind, die sich distal in einen Raum mit geringerer Elektronendichte, die Ringzone, erstrecken. F-Actin und Kapsidprotein sind in der Ringzone zusammen mit P78/83 und dem Arp2/3-Komplex kolokalisiert. Dieses Replikationsstadium wird sowohl durch Medikamente, die F-Actin unterbrechen, als auch durch das Fehlen von VLF-1 beeinträchtigt.
Mit Beginn der sehr späten Phase der Infektion kommt es zu einem Rückgang der BV-Produktion und zum Beginn der ODV-Produktion. Neu zusammengesetzte Nukleokapside bleiben im Zellkern, wo sie in Hüllen eingewickelt werden, die vermutlich von der inneren Kernmembran stammen. Umhüllte Virionen, nicht aber unumhüllte Nukleokapsiden, werden von einer Proteinmatrix umschlossen und bilden Kapseln oder Polyeder. Die Zellen lysieren schließlich und geben die Umhüllungen in das Medium ab.