Mechanismus der DNA-Synthese

Von Dr. Maho Yokoyama, Ph.D.Überprüft von Hannah Simmons, M.Sc.

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DNA, oder Desoxyribonukleinsäure, ist das biologische Molekül, das die Informationen enthält, die zur Schaffung eines lebenden Organismus benötigt werden. Wenn sich eine Zelle teilt, muss die DNA kopiert werden, damit beide Zellen die notwendigen genetischen Informationen enthalten. Die Synthese bzw. Herstellung neuer DNA-Stränge in lebenden Zellen wird als „DNA-Replikation“ bezeichnet.

DNA-Replikation. Bildnachweis: Designua /

Herstellung eines neuen DNA-Strangs

Die DNA liegt als Doppelhelix vor, bei der zwei DNA-Stränge zu zwei Helices zusammengebunden sind. Der Prozess der DNA-Replikation beginnt, wenn sich die beiden DNA-Stränge trennen. Ein Enzym namens Helikase wickelt die Bindungen zwischen den beiden DNA-Strängen ab und trennt sie, und die beiden getrennten Stränge dienen als Vorlagen, aus denen neue DNA hergestellt wird.

DNA-Polymerasen sind eine Gruppe von Enzymen, die neue DNA herstellen. Damit dieses Enzym arbeiten kann, benötigt es einen Primer – eine kurze Nukleotidsequenz, die an einen der einzelnen DNA-Stränge angehängt wird. Bei der DNA-Replikation ist der Primer in der Regel eine kurze Ribonukleinsäuresequenz (RNA), die später abgebaut und durch DNA ersetzt wird.

Der Primer liefert eine 3′-Hydroxylgruppe, an die die DNA-Polymerase die Vorstufen der DNA, die Nukleotide, anhängt. Wenn Nukleotide an das 3′-Ende des Primers oder des neuen DNA-Strangs angefügt werden, entsteht eine Bindung zwischen der 3′-Hydroxylgruppe des Primers/der neuen DNA und der 5′-Phosphatgruppe des Nukleotids.

Es gibt vier Arten von DNA-Nukleotiden, die jeweils unterschiedliche Stickstoffbasen haben: Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) und Thymin (T). Sie liegen immer paarweise vor: A-T und C-G. Dies wird als „Watson-Crick-Basenpaarung“ bezeichnet, d. h. wenn die Vorlage ein A-Nukleotid enthält, wird ein T-Nukleotid an den wachsenden DNA-Strang angefügt. Handelt es sich um ein „G“-Nukleotid, so wird ein „C“-Nukleotid an den wachsenden Strang angefügt.

Die Richtungsabhängigkeit der DNA und ihre Auswirkungen auf die DNA-Synthese

Die DNA hat eine Richtungsabhängigkeit, wobei ein Strang von 5′ nach 3′ und der andere von 3′ nach 5′ verläuft. Im 5′-3′-Strang liegt das 3′-Ende bei der Synthese neuer DNA frei. Das bedeutet, dass die DNA-Polymerase in der Lage ist, neue DNA in Richtung der Vorlagen-DNA zu bilden.

Beim 3′-5′-Strang würde jedoch das 5′-Ende exponiert bleiben; wie geht die DNA-Polymerase damit um? Im 3′-5′-Strang wird neue DNA gebildet, indem die DNA-Polymerase kurze 5′-3′-Fragmente, sogenannte Okazaki-Fragmente, herstellt. Dann verbindet ein anderes Enzym, die DNA-Ligase, die Okazaki-Fragmente miteinander, um den neuen 3′-5′-DNA-Strang zu bilden.

Proof-Reading

Gelegentlich werden beim Anfügen von Nukleotiden an den Vorlagen-DNA-Strang Fehler gemacht. Einige DNA-Polymerasen besitzen eine so genannte „3′-5′-Exonuklease-Aktivität“. Die 3′-5′-Exonukleaseaktivität arbeitet gegen die Polymerase- oder Syntheseaktivität und schneidet Nukleotide ab, die nicht zur Vorlage passen. Auf diese Weise wird der neue DNA-Strang so genau wie möglich gelesen.

Wie wird dies in der Molekularbiologie genutzt?

Die Eigenschaften der DNA-Synthese wurden in verschiedenen molekularbiologischen Techniken genutzt; Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und DNA-Sequenzierung.

Polymerase-Kettenreaktion

PCR ist eine in den 1980er Jahren entwickelte Technik zur Vervielfältigung eines bestimmten Teils der DNA. Die DNA-Primer sind so konzipiert, dass sie den interessierenden Bereich abdecken. Durch Erhitzen werden die beiden DNA-Stränge getrennt, und die Temperatur wird dann gesenkt, damit die Primer an die DNA gebunden werden können. Eine hitzestabile DNA-Polymerase stellt dann neue DNA-Stränge her, die mit der interessierenden Region übereinstimmen, indem sie Nukleotide an das 3′-Ende der Primer anhängt.

DNA-Sequenzierung

DNA-Sequenzierung bedeutet, die Reihenfolge der Basen (A, C, G, T) in der DNA zu bestimmen. Die Sanger-Sequenzierung ist eine der ersten DNA-Sequenzierungstechniken, bei der die DNA-Synthese angehalten wird. Dies wird durch die Entfernung der Hydroxylgruppe vom 3′-Ende der Nukleotide ermöglicht. Wenn diese „Dideoxy-Nukleotide“ in den DNA-Strang eingebaut werden, kann die DNA-Polymerase daher nicht das nächste Nukleotid hinzufügen. Diese Dideoxy-Nukleotide werden mit Nukleotiden vermischt, wodurch Fragmente unterschiedlicher Länge entstehen. Indem man Dideoxy-A, Dideoxy-C, Dideoxy-G und Dideoxy-T in getrennten Reaktionen herstellt, kann das letzte Nukleotid des Fragments bestimmt werden. Nach der Trennung nach der Größe kann die DNA-Sequenz dann bestimmt werden, indem das letzte Nukleotid der Fragmente nach der Größe betrachtet wird.

Obwohl moderne DNA-Sequenzierungsmethoden automatisiert und weniger arbeitsaufwendig als die Sanger-Sequenzierung sind, gibt es einige, die auf der Sanger-Sequenzierung basieren; zum Beispiel können zu jedem Dideoxy-Nukleotid verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe hinzugefügt und die Unterschiede durch verschiedene Fluoreszenzfarben nachgewiesen werden.

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Verfasst von

Dr. Maho Yokoyama

Dr. Maho Yokoyama ist Forscherin und Wissenschaftsautorin. Sie promovierte an der University of Bath, Großbritannien, mit einer Arbeit auf dem Gebiet der Mikrobiologie, in der sie funktionelle Genomik auf Staphylococcus aureus anwandte. Während ihres Promotionsstudiums arbeitete Maho mit anderen Wissenschaftlern an mehreren Arbeiten zusammen und veröffentlichte sogar einige ihrer eigenen Arbeiten in von Experten begutachteten Fachzeitschriften. Sie präsentierte ihre Arbeit auch auf wissenschaftlichen Konferenzen auf der ganzen Welt.

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