Patogeneesi In Vitro
Kolumnaariset epiteelisolut ovat umpisoluja, jotka kokevat kaksi pH:n ääripäätä samanaikaisesti. Apikaalisesti ne kylpevät erittäin emäksisissä suolenesteissä ja basaalisesti ne kylpevät lievästi happamassa hemolymfassa. Näitä olosuhteita on vaikea jäljitellä soluviljelyssä, mikä saattaa selittää primääri-infektiosta saatavilla olevan tiedon vähäisyyden.
Solulinjat, jotka tukevat GV:n replikaatiota, ovat harvinaisia, ja niitä on tällä hetkellä olemassa vain CpGV:lle. Näin ollen tiedämme vähän enemmän GV-infektion mekanismeista kuin ODV-infektiosta. Silti tiedämme, että GV:n nukleokapsidin morfogeneesin aikana isäntäsolun ydinkalvo hajoaa, mikä ei häiritse nukleokapsidin prosessointia. Ydinkalvon katoaminen on ominaista, eikä sitä tapahdu NPV-infektoituneissa isäntäsoluissa.
On perustettu useita hyönteissolulinjoja, jotka tukevat NPV-infektioita. Useimmat solulinjat ovat peräisin toukkien munasarjoista tai alkioista. AcMNPV voi replikoitua useista hyönteislajeista peräisin olevissa solulinjoissa, mikä on osaltaan vaikuttanut siihen, että se on parhaiten tutkittu bakulovirus. Vakioidussa yksivaiheisessa kasvukäyrässä AcMNPV:n BV:t syntyvät tyypillisesti 12-20 h infektion jälkeen (hpi) ja okkluusiot 20-48 hpi. Useimpien muiden NPV:iden lisääntyminen soluviljelmissä kestää tunteja tai päiviä pidempään.
AcMNPV BV on 1000-kertaisesti tarttuvampi kuin ODV, mikä johtuu pääasiassa sen fuusioproteiinin, GP64:n, läsnäolosta. BV:t pääsevät kohdesoluihinsa klatriinivälitteisen endosytoosin avulla. BV:n nukleokapsidit tunkeutuvat syvälle kohdesolujen sytoplasmaan vapautumalla endosomeista. Tämän strategian avulla nukleokapsidit ohittavat plasmakalvon alapuolella olevan mahdollisesti vaarallisen ympäristön ja pääsevät soluun lähemmäs ydintä kuin plasmakalvolla tapahtuva fuusio mahdollistaisi. BV:n fuusioproteiinien kokemat pH-herkät konformaatiomuutokset toimivat viruksen kuoren ja endosomaalisen kalvon välisen fuusiotapahtuman laukaisijoina.
AcMNPV:n nukleokapsidin pakenemista endosomista seuraa välittömästi sen assosiaatio F-aktiiniköysien kanssa. Kaapeleiden muodostuminen on ohimenevää, ja se tapahtuu sinä aikana, kun viruksen nukleokapsidit siirtyvät tumaan ja pääsevät tumaan. Kuljetuksen aikana virusnukleokapsidit lokalisoituvat aktiinikaapelin toiseen päähän, mahdollisesti P78/83:n kautta, joka on F-aktiiniä sitova proteiini, jonka uskotaan sijaitsevan nukleokapsidien pohjalla. Nukleokapsidien liittyminen F-aktiinikaapeleihin ja reportterigeenin ilmentymisen viivästyminen sellaisten lääkeaineiden läsnäollessa, jotka häiritsevät aktiini/myosiinitoimintaa, viittaavat siihen, että kaapelit voivat helpottaa nukleokapsidien kulkeutumista ytimeen tai välittää niiden kulkeutumista ydinkeräyshuokosten läpi.
NPV:n ja joidenkin GV:iden nukleokapsidit kulkeutuvat ytimeen ydinkeräyshuokosten kautta. Jotkin GV:t purkautuvat ydinhuokosissa, mutta suurin osa bakulovirusten purkautumisesta tapahtuu tuman sisällä. Varhainen geenien transkriptio alkaa välittömästi isännän RNA-polymeraasi II:n (Pol II) välityksellä. Varhaisten geenien joukossa on osajoukko, jonka ilmentyminen johtaa tehokkaaseen G-aktiinin kulkeutumiseen tumaan ja kertymiseen tumaan (kuva 5). Tämä näyttävä aktiinin lokalisaation manipulointi on kriittinen tekijä NPV:n jälkeläistuotannolle, eikä sitä ole kuvattu minkään muun patogeenin kohdalla. Transienttisissa transfektiokokeissa tunnistettuja aktiinin ydinlokalisaatioon osallistuvia geenejä ovat ie1, pe38, Ac004, Ac152, he65 ja Ac102. Kaksi näistä geeneistä, ie1 ja Ac102, on konservoitunut kaikkien lepidopteran NPV:iden ja GV:iden keskuudessa, ja molemmat ovat välttämättömiä.
Kuvio 5. Geenit. Ydin G-aktiini AcMNPV-infektoituneissa soluissa. (a) 4′,6-diamidino-2-fenylindoli (DAPI) -värjätyt infektoituneet solut; (b) infektoitunut solu, joka ilmentää transfektoitua vihreää fluoresoivaa proteiinia (GFP)-aktiinia. (c) Ytimen rodamiinifalloidiinivärjäytymisen puuttuminen osoittaa, että ydinaktiini on monomeerinen.
Transitio infektion myöhäisvaiheeseen on BV:n jälkeläistuotantojakson alku; solutoiminnot suuntautuvat viruskomponenttien syntetisoimiseen maksimaalisella vauhdilla, niiden kokoamiseen nukleokapsidituotteiksi ja sen jälkeen niiden vientiin. Isännän makromolekyylisynteesi pysähtyy tänä aikana, mutta isännän kromatiinirakenne säilyy ehjänä solukuolemaan asti. Myöhäisiä ja hyvin myöhäisiä viruksen geenejä ilmentää viruksen koodaama RNA-polymeraasi.
Mikrotubulukset, jotka järjestäytyvät uudelleen infektion varhaisen vaiheen aikana, depolymerisoituvat myöhäisen vaiheen aikana tuotettujen tekijöiden vaikutuksesta, mikä johtaa solun pyöristymiseen (kuva 6). Vastaavasti G-aktiini, joka kertyi tumaan varhaisvaiheen aikana, polymerisoituu myöhäisvaiheessa, jolloin ydin turpoaa ja näkyvät isännän ydinrakenteet häviävät (kuva 7). Virogeeninen strooma, viruksen DNA-synteesin tapahtumapaikka, muodostuu tuman keskelle, ja sen välissä ja ympärillä on elektronin läpikuultava vyöhyke, jota kutsutaan ”rengasvyöhykkeeksi”, paikka, jossa kapsidit kootaan ja sidotaan genomin lataamisen aikana. Ytimen F-aktiini lokalisoituu yhdessä AcMNPV:n tärkeimmän kapsidiproteiinin kanssa rengasvyöhykkeellä (kuva 7).
Kuva 6. Rengasvyöhyke. AcMNPV-infektoituneet Sf21-solut, joissa näkyy sytopaattisen vaikutuksen (CPE) eri vaiheita. (a) Infektoimattomat solut. Huomaa karan muoto ja nukleokromatiinirakenteiden läsnäolo. (b) AcMNPV-infektoituneet solut, joissa näkyy varhainen ja myöhäinen CPE. Solut ovat pyöristyneet mikrotubulusten depolymerisoitumisen vuoksi, tumat ovat suurempia ja puhdistuneet isäntärakenteista, ja virogeeninen strooma (vs) on rengasvyöhykkeen (rz) ympäröimä. Virogeeninen strooma tihenee infektion myöhäisvaiheen edetessä. Polyhedrat täyttävät tuman hyvin myöhäisessä infektiovaiheessa (p).
Kuva 7. Infektion myöhäinen vaihe. Ydin F-aktiini AcMNPV-infektoituneessa solussa myöhäisen geeniekspression aikana. (a) DAPI-värjäys osoittaa tuman sijainnin. (b) Vihreä fluoresenssi osoittaa, että kapsidiproteiini on lokalisoitunut pääasiassa tuman rengasvyöhykkeelle. (c) Rodamiinifalloidiinivärjäys osoittaa, että F-aktiini yhteislokalisoituu kapsidin kanssa rengasvyöhykkeessä.
Ytimen F-aktiiniä tarvitaan BV:n tuottamiseen. F-aktiiniä häiritsevien lääkeaineiden läsnä ollessa viruskapsidit ovat epämuodostuneita ja näkyvät pitkinä putkimaisina rakenteina, jotka ovat vierekkäin ytimen sisemmän kalvon kanssa ja joissa on harvakseltaan elektronitiheän materiaalin laikkuja. Normaalisti esiintyviä pohjalevyjä ja korkkirakenteita ei näy, ja kalvoprofiileja syntyy liikaa. Viruksen DNA-synteesiä tapahtuu normaalilla nopeudella, mutta genomeja ei ole pakattu, ja virogeeninen strooma on normaaliin stroomaan verrattuna ”rennon” näköinen. Mielenkiintoista on, että AcMNPV:n very late factor-1:n (VLF-1) puuttuessa fenotyyppi on samankaltainen, mikä viittaa siihen, että VLF-1 saattaa osallistua kapsidien sitomiseen virogeeniseen stroomaan ja että F-aktiini on stroman komponentti, johon kapsidit kiinnittyvät suoraan tai epäsuorasti.
P78/83, vähäinen kapsidiproteiini, joka ilmentyy myöhäisessä vaiheessa infektiota, on välttämätön AcMNPV:n elinkykyisyyden kannalta. Tämä ominaisuus havaittiin yli 30 vuotta sitten ja sitä hyödynnettiin ensimmäisissä kaupallisissa bakulovirusten ilmentämissarjoissa. P78/83:n (78 kDa fosforyloimattomana ja 83 kDa fosforyloiduna) uskotaan olevan osa sekä BV- että ODV-kapsidien peruslevyjä. P78/83 on F-aktiiniä sitova proteiini, ja tämä aktiivisuus saattaa auttaa kiinnittämään kapsidit ydinmatriisiin kokoonpanon aikana. Mielenkiintoista on, että P78/83:lla on toinenkin aktiivisuus, joka selittää, miksi se on välttämätön; se edistää aktiinin polymerisaatiota ytimessä. P78/83 sisältää domeeneja, jotka ovat konservoituneet Wiskott-Aldrichin oireyhtymän proteiiniperheen (WASP) jäsenissä, jotka edistävät aktiinifilamenttien ydintymistä. WASP-perheen jäsenet säätelevät positiivisesti aktiniiniin liittyvän proteiini (Arp)-2/3-kompleksin aktiinin ydintymisaktiivisuutta. Seitsemän alayksikön kompleksi, joka on konservoitunut kaikissa eukaryooteissa, translokoituu tumaan AcMNPV-infektoituneissa soluissa ja aktivoituu P78/83:n avulla. P78/83:n mutaatiot, jotka johtavat heikentyneeseen kykyyn edistää aktiinin ydintymistä, johtavat vastaavasti heikentyneeseen kykyyn tuottaa infektiivistä BV:tä.
Heti tumaan päästyään AcMNPV:n DNA omaksuu nukleosomaalisen rakenteen ja käyttää nukleosomeja ja nukleosomiin liittyviä prosesseja genomin replikaatiossa. Viruksen replikaatiostrategian osa näyttää siis olevan isännän kromatiinin uudelleenmuodostuskapasiteetin osien, ellei peräti koko kromatiinin uudelleenmuodostuskapasiteetin, kaappaaminen. Viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, että BRO (baculovirus repeated orf) -proteiiniperhe osallistuu todennäköisesti tähän prosessiin. BRO-proteiinit ilmentyvät varhain infektion aikana, ne sitovat yksijuosteista DNA:ta (ssDNA) ja ydinhistoneita ja jakautuvat histonien kanssa fraktiointikokeissa. BmNPV:llä, orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedroviruksella ja lymantria dispar multiple nucleopolyhedroviruksella on kaikilla useita Bro-geenejä. AcMNPV:llä on vain yksi bro-geeni, joka on sukua BmNPV:n bro-d:lle ja joka on välttämätön.
AcMNPV:n koodaama P6.9, joka on erittäin emäksinen genomin pakkausproteiini, alkaa kerääntyä infektion myöhäisvaiheessa, ja vaihtoehtoinen kromatiinirakenne syntyy.
P6.9:n ja DNA:n välisiä vuorovaikutussuhteita kontrolloidaan P6.9:n fosforylaatiotilalla. Genomin pakkaamisen aikana virogeenisesta stroomasta peräisin oleva genominen DNA sitoutuu P6.9:n kanssa P6.9:n defosforyloidessa, jolloin se tiivistyy valmiiksi muodostuneeseen kapsidivaippaan kartiomaisen päätyrakenteen aukon kautta. Kartiomaiset rakenteet sijaitsevat proksimaalisesti virogeeniseen stroomaan nähden, ja kapsiditupet on peitetty peruslevyillä, jotka ulottuvat distaalisesti vähemmän elektronitiheään tilaan, rengasvyöhykkeeseen. F-aktiini ja kapsidiproteiini sekä P78/83 ja Arp2/3-kompleksi lokalisoituvat yhdessä rengasvyöhykkeessä. Tähän replikaatiovaiheeseen vaikuttavat sekä lääkkeet, jotka häiritsevät F-aktiiniä, että VLF-1:n puuttuminen.
Infektion hyvin myöhäisen vaiheen alkaessa BV-tuotanto vähenee ja ODV-tuotanto alkaa. Vastikään kootut nukleokapsidit pysyvät tuman sisällä, jossa ne kietoutuvat kuoriin, joiden uskotaan olevan peräisin sisäisestä ydinkalvosta. Koteloidut virionit, mutta eivät koteloimattomat nukleokapsidit, sulkeutuvat proteiinimatriisiin muodostaen kapseleita tai polyederejä. Solut lopulta lyseoituvat, jolloin okkluusiot vapautuvat väliaineeseen.