Materiaalit ja menetelmät
Duplex DNA Preparation. 30-bp:n duplex-DNA-molekyylien valmistamiseksi hybridisoitiin kaksi oligonukleotidia, joilla oli seuraava sekvenssi ja muutokset (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Oligonukleotidi 5′-GGGTATGGGGAGATTTTTAGCGGAGTGACAGC-3′ leimattiin Cy5:llä sen 5′-päässä ja Cy3:lla sen 3′-päässä. Komplementaarinen oligonukleotidi leimattiin biotiinilla molemmissa päissä.
Proteiinin ilmentäminen ja puhdistus. Keltaisen fluoresoivan proteiinin (YFP) geeni p2Bac/pFastBac-YFP-M5-CaM-plasmidissa (lahja H. Lee Sweeneyltä, Pennsylvanian yliopisto, Philadelphia) poistettiin PCR:llä. Näin saatu p2Bac/pFastBac-M5-CaM-plasmidi koodaa kanan myosiini V:tä, joka on typistetty Glu-1099 kohdassa. Natiivin kierukan jälkeen on leusiinivetoketju, joka varmistaa dimerisaation. Puhdistuksen helpottamiseksi myosiini V -proteiini merkittiin N-terminaalisesti FLAG-tagilla (DYKDDDDK). Proteiinin ilmentämiseksi Sf9-soluissa tuotettiin kaksi rekombinanttibaculovirusta. Toinen koodasi typistettyä myosiini V:tä ja Drosophila melanogasterin kalmoduliinia, joka oli peräisin p2Bac/pFastBac-M5-CaM-plasmidista. Toinen virus koodasi ihmisen välttämätöntä kevyttä ketjua, joka oli peräisin p2Bac/pFastBac-ELC-plasmidista. Molempia viruksia käytettiin Sf9-solujen koinfektioon. Proteiini ekspressoitiin ja puhdistettiin Sweeneyn ym. kuvaamalla tavalla (20).
Kalmoduliinin merkitseminen ja vaihto. Kalmoduliini ekspressoitiin ja merkittiin Cy3:lla tai Cy5:lla seuraavasti: Merisiilin kalmoduliiniin lisättiin yksi kysteiini mutaatiolla Q143C. Tämä kalmoduliini ekspressoitiin Escherichia coli -bakteerissa ja puhdistettiin kohdassa 21 kuvatulla tavalla. Kalmoduliini leimattiin joko Cy3-maleimidin tai Cy5-maleimidin (Amersham Biosciences) kantaliuoksilla (DMSO:ssa) 1,4-kertaisella moolisuhteella 20 minuutin ajan. Ylimääräinen väriaine poistettiin geelisuodattamalla vaihtopuskuriin (jäljempänä), minkä jälkeen se absorboitiin yön yli hydrofobisesti BioBeads-hiukkasiin (Bio-Rad). Merkin sitoutuminen oli 102 % Cy3-kalmoduliinille ja 75 % Cy5-kalmoduliinille. Aliquotit säilytettiin -80 °C:ssa.
Merkityn kalmoduliinin vaihto myosiini V:hen suoritettiin kuvatulla tavalla, mutta muutamin muutoksin (22). Myosiini V:tä (150 nM) inkuboitiin 0,7 nM Cy3-merkityn kalmoduliinin ja 0,8 nM Cy5-merkityn kalmoduliinin kanssa vaihtopuskurissa (25 mM KCl/20 mM imidatsolihydroksidihydroksidia, pH 7,4/2 mM MgCl2/1 mM EGTA) 22 °C:n lämpötilassa 2 minuutin ajan. Kalmoduliinien vaihtamiseksi lisättiin 0,9 mM CaCl2 ja seosta inkuboitiin 22 °C:ssa 5 min. Reaktio sammutettiin 7 mM EGTA:lla. Reaktioseos levitettiin 100K MWCO Nanocep -ultrasuodatuslaitteeseen (Pall) ja pestiin kolme kertaa yhtä suurilla määrillä AB:tä (alla) myosiini V:n puhdistamiseksi ylimääräisestä kalmoduliinista.
Virtaussolun valmistelu. Virtauskenno rakennettiin lasisesta mikroskooppilasista ja NLAF21:stä (VA Optical Labs, San Anselmo, CA) tehdyistä voimakkaasti taittuvista peitelevyistä, jotka pidettiin kiinni toisiinsa kaksipuolisen skotlantilaisen teipin paloilla.
Myosiini V -kokeissa 15 μl biotiini-BSA:ta (1 mg-ml-1) inkuboitiin virtauskennossa 2 minuutin ajan, minkä jälkeen 30 μl AB-puskuria (25 mM KCl/25 mM imidatsoli-HCl, pH 7,4/1 mM EGTA/4 mM MgCl2/10 mM DTT/1 mg-ml-1 BSA) ohjattiin virtauskennon läpi sen huuhtelemiseksi. Soluun lisättiin 15 mikrolitraa 0,5 mg/ml NeutrAvidiinia (Molecular Probes), jonka annettiin inkuboitua 2 minuutin ajan, minkä jälkeen tehtiin toinen pesu AB-puskurilla. Virtaussolua inkuboitiin 15 μl:lla biotinyloitua falloidiiniaktinifilamenttia (250 nM) 5 minuutin ajan, minkä jälkeen 100 μl pestiin AB-puskurilla. Lopuksi solu ladattiin 20 μl:lla kuvantamispuskuria, joka sisälsi kalmoduliininvaihdettua myosiini V:tä, 5 μM kalmoduliinia, 300 nM ATP:tä, ATP:n regeneroivaa järjestelmää (0,1 mg-ml-1 kreatiinifosfokinaasi/1 mM kreatiinifosfaattia) ja 0,5 %:n (tilavuusprosentti/tilavuusprosentti) Triton-X 100:a epäspesifisen sitoutumisen vähentämiseksi. Solu suljettiin tyhjiörasvalla ja kuvattiin välittömästi. Lopullinen moottorikonsentraatio johti harvaan koristeltuun aktiiniin ja mahdollisti siten yksittäisten myosiini V -molekyylien analysoinnin.
DNA-kokeita varten biotiini-BSA ja NeutrAvidiini ladattiin samalla tavalla kuin myosiini V -kokeita varten, mutta pesut tehtiin T50-puskurilla (10 mM Tris, pH 8,0/50 mM NaCl). Kun virtaussolussa oli NeutrAvidiinipinnoite, 15 μlo dsDNA:ta (30 nM) T50-puskurissa, jossa oli 1 mg-ml-1 BSA:ta, virrattiin sisään ja inkuboitiin 2 minuutin ajan, minkä jälkeen sisään virrattiin 100 μl kuvantamispuskuria. Tämän jälkeen virtauskenno suljettiin tyhjiörasvalla ja kuvattiin välittömästi. Syntynyt DNA-molekyylien koristelu pinnalla oli riittävän harva, jotta eri molekyyleistä peräisin olevat fluoresoivat täplät harvoin menivät päällekkäin.
Mikroskooppiasetelma. TIRF-mikroskooppi (Total Internal Reflection Fluorescence, sisäinen kokonaisheijastusfluoresenssi) asetettiin siten kuin on kuvattu ref. 8 kuvatulla tavalla eräin muutoksin (kuva 5, joka on julkaistu tukitietona PNAS-sivustolla). 532 nm:n (Coherent, Santa Clara, CA) ja 633 nm:n (JDS Uniphase, San Jose, CA) herätelähteiden säteet yhdistettiin dikropeilillä ja laajennettiin 7 mm:n halkaisijaksi. Nämä lähteet fokusoitiin (polttoväli = 500 mm) Olympuksen 1,65 NA ×100 TIRF-objektiivin takatulotasoon lineaarisen DeepL translaatiossa olevan laserlinjadikroosin avulla, joka mahdollistaa mikroskoopin käytön joko epifluoresenssi- tai TIRF-tilassa. Objektiivi asetettiin suljetun silmukan, kaksiakselisen, piezo-nanoDeepL-käännöksen alle, joka on varustettu kapasitiivisilla antureilla asennon mittausta varten (Physik Instrumente, Auburn, MA). Objektiivin taka-aukosta tuleva heijastunut valo suunnattiin kvadranttifotodiodille, joka antoi signaalin tarkennuksen takaisinkytkentäsilmukalle, joka puristi objektiivin ja näytteen välisen etäisyyden sähköstriktiivisellä toimilaitteella (Newport, Fountain Valley, CA). Objektiivi keräsi fluoresenssiemissiota, se ohjattiin kahden StopLine-ohutkalvosuodattimen (Semrock, Rochester, NY) läpi, yksi kutakin herätelähdettä varten, ja se välitettiin kaksoiskuvauslaitteen läpi, joka mahdollisti Cy3- ja Cy5-kanavien samanaikaisen kuvaamisen yhdellä iXon DV 887 EMCCD-kameralla (Andor Technology, Belfast, Irlanti). Kaikki tiedot kuvattiin 0,5 sekunnin integrointiajalla. Kahden kanavan välinen ristikkäishäiriö (10 %) oletettavasti vääristää etäisyysmittauksia kohti pienempiä arvoja. Kokeellinen virheemme tekee siitä kuitenkin havaitsemattoman, kuten Monte Carlo -simulaatiot osoittavat, joissa luotiin 100 paria mallinnettuja kuvia yksittäisistä 10 nm:n etäisyydellä toisistaan olevista fluorofooreista ja analysoitiin samalla tavalla kuin DNA-datan kanssa (kuvattu jäljempänä). Simuloidut kuvat fluoresoivien pisteiden leviämisfunktioista laskettiin luomalla integroitu 2D-Gaussin intensiteettijakauma, jossa on vakio tausta, johon lisättiin laukauskohinaa. Simuloitujen piikkien mitat ja signaali-kohinasuhde olivat samat kuin todellisilla piikeillä. Simuloidut tiedot, joissa on 10 % ristikkäisvärähtelyä, ja simuloidut tiedot, joissa ei ole ristikkäisvärähtelyä, eivät eroa toisistaan Kolmogorov-Smirnovin testillä (N 1 = 100, N 2 = 100, p > 0,05).
Tietojen analysointi. Cy3- ja Cy5-kanavien rekisteröintikartoitus tehtiin 100 nm:n TransFluoSphere-helmistä (Molecular Probes) koostuvien fiducialien avulla. Ne herätettiin 532 nm:ssä, ja ne emittoivat laajalla emissiospektrillä. Helmi oli havaittavissa molemmissa kanavissa. Paikansimme yhden helmen, joka oli liitetty peitelevyyn, ja askelsimme sitä pietsoalustallamme nanometrin tarkkuudella ruudukkokuvioittain (0,5 μm:n välein) ja otimme kuvan jokaisella pysähdyksellä. Lopputuloksena oli 312 kuvan pino, jossa helmi näkyy molemmissa kanavissa eri paikoissa (kuva 1a ).
DNA-tiedot analysoitiin kotitekoisella ohjelmistolla käyttäen Matlabia (Mathworks, Natick, MA). Rutiini paikallistaa automaattisesti piikit kuvasta määrittämällä korkean intensiteetin pikselit ja varmistaa, että ympäröivien pikselien intensiteetit ovat yhden fluorofoorin osalta odotetun mukaiset. Ennen piikkien sovittamista 2D-Gaussin funktioon sen keskipisteiden sijainnin saamiseksi etsitään piikkipareja. Cy5-kanavasta löydetyt pikselit kartoitetaan Cy3-kanavaan ja etsitään piikkejä ympäröivistä Cy3-pikseleistä. Jos piikki löytyy, Cy5-piikki ja Cy3-piikki katsotaan pariksi jatkoanalyysiä varten. Kukin piikki sovitetaan 2D-Gaussin funktioon omassa tilassaan, kuten edellä on kuvattu helmien osalta (yhtälö 1 ). Sovituksen keskimääräisen sijainnin virhe lasketaan kerättyjen fotonien lukumäärän (Nγ) avulla, 
Cy5:n sijainti kartoitetaan Cy3-kanavaan, ja niiden välinen etäisyys lasketaan. DNA-datan laskennallisen analyysin jälkeen tunnistetut fluorofooriparit seulottiin manuaalisesti sen varmistamiseksi, että parit eivät olleet lähellä muita fluorofooreja, jotka olisivat häirinneet parien analyysia.
Myosiini V -data analysoitiin tunnistamalla ensin silmämääräisesti liikkuva moottori. Matlabilla kirjoitettu kotitekoinen ohjelmisto sovitti sitten lähtöparin fluoresenssipiikit 2D-Gaussin funktioihin edellä kuvatulla tavalla ja jatkoi piikkien seuraamista niin kauan kuin käyttäjä oli määritellyt. Analysoitiin moottorit, joiden konjugoidut väriaineet kukin photobleached yhdellä askeleella, kuten tapahtui useimpien havaittujen moottoreiden kohdalla, mikä varmisti, että tutkittiin moottoreita, joissa oli vain yksi Cy3- ja yksi Cy5-merkki. Tuloksena saadut liikeradat rekisteröitiin kuvaamalla Cy5:n liikerata Cy3-kanavaan. Pienimmän neliösumman lineaarinen sovitus molempien liikeratojen pisteisiin antoi aktiinifilamentin suunnan, johon liikeradat projisoitiin. Lineaarisen sovituksen pituiset etäisyydet (aktiinifilamentti) piirrettiin ajan suhteen, jotta saatiin selville päiden suhteelliset etäisyydet (kuva 4).
Aikajälki differentiaalisesti leimatusta myosiini V -molekyylistä, joka kulkee aktiinifilamenttia pitkin. Leimat (Cy3 ja Cy5) on kiinnitetty kovalenttisesti kalmoduliineihin, jotka on vaihdettu myosiini V -molekyylin päälle. Tässä jäljityksessä molemmat fluoresoivan koettimen sijainnit ottavat 72 nm:n askelia, mikä osoittaa, että kalmoduliinit vaihdettiin lähelle motorista domeenia. Koettimien vaihtuvat sijainnit tarjoavat suoran havainnon myosiini V:n kädestä käteen -kävelymekanismista.