Acendance commune des facteurs de transcription homéobox TALE hétérodimérisants à travers les Metazoa et les Archaeplastida

Les TALE chez les Archaeplastida sont divisés en deux groupes , KNOX et non-KNOX

Pour rassembler toutes les séquences de protéines homéobox disponibles, nous avons effectué des recherches BLAST et Pfam-motif contre des génomes non végétaux et des assemblages de transcriptomes à travers les Archaeplastida, identifiant 338 protéines de 56 espèces comme la collection homéobox des Archaeplastida (30 génomes et 18 transcriptomes ; Fichier supplémentaire 1 : Tableau S1). Parmi celles-ci, 104 possédaient la caractéristique déterminante des protéines TALE, une insertion de trois acides aminés entre les positions 23 et 24 de l’homéodomaine. Au moins deux gènes TALE ont été détectés dans la plupart des génomes, à l’exception de cinq génomes de la classe des Trebouxiophyceae des Chlorophyta (fichier supplémentaire 1 : tableau S1 ; voir le fichier supplémentaire 2 : note S1 pour une discussion plus approfondie de l’absence de TALE chez les Trebouxiophyceae).

Les séquences TALE collectées ont ensuite été classées selon leurs caractéristiques homéodomaines à l’aide d’une approche phylogénétique, les TALE des animaux, des plantes et des eucaryotes à divergence précoce (Amoebozoa et Excavata) constituant des sous-groupes (fichier supplémentaire 3 : figure S1). La phylogénie résultante des homéodomaines TALE distingue deux groupes dans les trois phyla d’Archaeplastida (Fig. 2). (1) Le groupe KNOX, en tant que clade bien soutenu, présentait un cladogramme spécifique au phylum : deux séquences Glaucophyta à la base (comme KNOX-Glauco) étaient séparées du clade suivant, qui combine des séquences Rhodophyta (comme KNOX-Red1) et un clade spécifique à Viridiplantae avec un fort soutien (92/90/1,00). (2) Le groupe non-KNOX, incluant les homologues de BELL et GSP1, contenait des clades d’affiliations taxonomiques mixtes. Ces analyses ont montré que les protéines TALE avaient déjà divergé en deux groupes avant l’évolution des Archaeplastides et que le groupe KNOX est hautement conservé dans l’ensemble des Archaeplastides.

La phylogénie à maximum de vraisemblance (ML) de l’homéodomaine de la superclasse TALE chez les Archaeplastidés soutient une division ancienne entre les groupes TALE KNOX- et non-KNOX. Les arbres ML ont été générés à partir de l’alignement des homéodomaines avec 70 positions d’acides aminés. L’arbre consensuel obtenu à partir de 1000 arbres bootstrap est présenté. Les trois chiffres aux nœuds critiques indiquent le %bootstrap, le %SH et la probabilité postérieure bayésienne à l’appui des clades. L’arbre contient deux clades d’outgroup marqués par des carrés noirs aux nœuds, et deux clades Archaeplastida, l’un combinant la plupart des séquences KNOX marquées par le carré rouge et l’autre combinant toutes les séquences non-KNOX marquées par le carré bleu. Les barres verticales sur la droite représentent la distribution de l’outgroup en noir, des séquences KNOX en rouge, et des séquences non-KNOX en bleu. Les points rouges à côté des noms de séquence indiquent la présence de domaines KN-A ou KN-B, et les points bleus indiquent la présence d’un domaine d’homologie PBC. Les séquences tronquées non disponibles pour l’analyse des domaines d’homologie sont marquées par des boîtes noires ouvertes. Les cases noires remplies indiquent l’absence d’un domaine d’homologie KN-A/B ou PBC. La classification proposée est indiquée par les lignes verticales. Les lignes verticales en pointillés indiquent les membres de la classe suggérée placés en dehors du clade principal de la classe dans la phylogénie. Les séquences PBX-Red se trouvent dans quatre clades distincts, marqués par des nuances de violet sur la section bleue des barres verticales. Deux séquences PBX-Red marquées par le carré violet sont exceptionnellement trouvées dans le clade KNOX-Red1, ayant des acides aminés divergents à des positions hautement conservées à Trp19, His23, et Lys31 dans leur homéodomaine, suggérant leur fausse association avec le KNOX-Red1. Les couleurs des noms de séquences indiquent leur groupe phylogénétique : Bleu pour Glaucophyta, violet pour Rhodophyta, vert pour les prasinophytes, bleu clair pour les chlorophytes, orange pour Streptophyta, et noir pour les outgroups. La règle indique la distance génétique. Les détails des séquences analysées par cette phylogénie sont fournis dans le fichier additionnel 1 : Tableau S2. *Gloeochaete_wittrockiana_014496 est considérée comme une séquence provenant d’une amibe de type bannelide qui a contaminé la culture originale (SAG46.84) pour le transcriptome MMETSP1089. **L’association des séquences de la classe KNOX-Red2 aux séquences PBC d’Amorphea est attribuée à un motif WFGN partagé déterminant la spécificité de liaison à l’ADN de l’homéodomaine via une évolution convergente

Les séquences du groupe KNOX partagent les mêmes domaines d’hétérodimérisation dans tout Archaeplastida

La question suivante était de savoir si la classe KNOX des plantes provenait avant le phylum Viridiplantae. Les protéines KNOX végétales et le GSM1 des Chlorophytes possèdent l’homologie KNOX, constituée des domaines KN-A, KN-B et ELK, nécessaire à leur hétérodimérisation avec d’autres protéines TALE ; par conséquent, la présence de l’homologie KNOX suggérerait le potentiel d’hétérodimérisation au groupe KNOX. Afin de recueillir des domaines d’homologie sans information préalable, nous avons effectué des recherches ad-hoc de domaines d’homologie parmi les séquences du groupe KNOX. En utilisant les domaines d’homologie identifiés comme points d’ancrage, nous avons soigneusement établi un alignement des séquences du groupe KNOX combinées à toute autre séquence TALE présentant une homologie KNOX (fichier supplémentaire 3 : figure S2). À partir de cet alignement KNOX, nous avons trouvé toutes les séquences du groupe KNOX (à l’exclusion des séquences partielles) montrant des scores de similarité d’acides aminés > 50% pour au moins deux des trois domaines comprenant la région d’homologie KNOX (fichier supplémentaire 1 : tableau S3 pour l’homologie de domaine calculée). Pour vérifier si la similarité observée est spécifique aux séquences TALE, nous avons généré des motifs HMM pour les domaines KN-A et KN-B à partir de l’alignement KNOX, nous les avons recherchés dans les génomes cibles et nous avons confirmé que les domaines KN-A et KN-B ne se trouvent que dans les séquences TALE (fichier supplémentaire 4 : données S1 et S2). Nous avons ainsi défini les homologues de KNOX comme les séquences TALE possédant une homologie KNOX recherchable (Fig 2, marquées par des points rouges suivant leurs ID), ce qui suggère que l’homologue de KNOX existait déjà avant l’évolution de la photosynthèse eucaryote représentée par les Archaeplastida.

En plus de l’homologie KNOX, la même recherche a également révélé deux nouveaux domaines à l’extrémité C-terminale de l’homéodomaine (fichier additionnel 3 : figure S2) : le premier (KN-C1) était partagé entre les séquences Chlorophyta, et le second (KN-C2) était partagé entre un groupe d’homologues KNOX dans un clade extérieur au groupe KNOX (KNOX-Red2).

Les classes KNOX ont divergé indépendamment parmi les phyla algaux

Dans les Viridiplantae, nous avons trouvé un seul homologue KNOX dans la plupart des espèces de Chlorophyta, tandis que la divergence KNOX1 et KNOX2 était évidente dans la division Streptophyta, y compris le charophyte Klebsormidium flaccidum et les plantes terrestres (Fig. 2). Le domaine KN-C1 nouvellement découvert était spécifique aux séquences KNOX des Chlorophyta et se trouvait dans toutes les espèces sauf une (Pyramimonas amylifera). L’absence de similarité entre le domaine KN-C1 et les extensions C-terminales des séquences KNOX1/KNOX2 suggère une évolution indépendante et spécifique de la lignée KNOX chez les Chlorophyta et les Streptophyta (fichier additionnel 3 : figure S2). Par conséquent, nous nous référons aux classes KNOX des Chlorophytes sous le nom de KNOX-Chloro, par opposition aux classes KNOX1 et KNOX2 des Streptophytes.

Les homologues KNOX des Rhodophytes ont été divisés en deux classes : un groupe paraphylétique proche du clade KNOX-Chloro, nommé KNOX-Red1, et un second groupe proche du groupe PBX-Out, nommé KNOX-Red2. KNOX-Red1 est dépourvu d’un domaine KN-A, tandis que KNOX-Red2 est dépourvu d’un ELK et partage un domaine KN-C2 (fichier additionnel 3 : figure S2). Nous considérons KNOX-Red1 comme le type ancestral, puisque les séquences KNOX-Red1 ont été trouvées dans tous les taxons Rhodophyta examinés, alors que les séquences KNOX-Red2 étaient limitées à deux classes taxonomiques (Cyanidiophyceae et Florideophyceae). Il est intéressant de noter que le clade KNOX-Red2 comprenait deux séquences d’algues vertes, avec un fort soutien statistique (89/89/0,97 ; Fig. 2) ; celles-ci possédaient un domaine KN-C2, ce qui suggère leur origine dans la classe KNOX-Red2 (Fichier supplémentaire 3 : Figure S2 ; voir Fichier supplémentaire 2 : Note S2 pour une discussion plus approfondie sur leur origine possible par transfert horizontal de gènes).

Les séquences TALE disponibles étaient limitées pour les Glaucophyta. Nous avons trouvé un seul homologue de KNOX dans deux espèces, qui possédait les domaines KN-A et KN-B mais manquait d’un domaine ELK. Nous les avons appelés KNOX-Glauco.

Les TALE du groupe non-KNOX possèdent un domaine d’homologie PBC de type animal, ce qui suggère une ascendance partagée entre Archaeplastida et Metazoa

Après l’identification des homologues de KNOX, les séquences TALE restantes ont été combinées comme le groupe non-KNOX qui manque de domaines KN-A et KN-B chez Archaeplastida. Une classification plus poussée du groupe non-KNOX s’est avérée difficile en raison de ses séquences homéodomaines très divergentes. Cependant, nous avons remarqué que le nombre de gènes non-KNOX par espèce était largement invariable : un dans la plupart des génomes de Rhodophyta et Glaucophyta et deux dans la majorité des génomes de Chlorophyta, ce qui suggère leur conservation au sein de chaque radiation.

Notre recherche d’homologie ad-hoc a fourni des informations critiques pour la classification non-KNOX, en identifiant un domaine d’homologie partagé entre toutes les séquences non-KNOX de Glaucophyta et Rhodophyta (Fig. 3a, b). Puisque ce domaine a montré une similarité avec la seconde moitié du domaine PBC-B animal (Pfam ID : PF03792) connu comme domaine d’hétérodimérisation, nous avons nommé ce domaine PBL (PBC-B Like). En conséquence, nous avons classé tous les TALEs non-KNOX dans Glaucophyta et Rhodophyta comme une classe unique de homeobox liée à PBC, PBX-Glauco ou PBX-Red. Les séquences PBX-Glauco possédaient également le motif MEINOX, conservé dans le domaine PBC-B animal, indiquant un ancêtre commun des domaines PBC-B et PBL (Fig. 3a).

Les TALE du groupe non-KNOX d’Archaeplastida possèdent un domaine de type PBC (PBL) constitué d’une homologie MEINOX N-terminale et d’une homologie PBC-B C-terminale. Les lettres d’acides aminés en noir avec des nuances de gris, en blanc avec des nuances claires, et en blanc avec des nuances de noir montrent plus de 60%, 80%, ou 100% de similarité dans chaque colonne. Les triangles rouges inversés indiquent les séquences écartées dans les insertions non alignées. a Alignement du domaine PBL-Glauco, incluant deux séquences Glaucophyta partageant une homologie à la fois dans l’homologie MEINOX et la moitié C-terminale du domaine PBC-B avec des séquences TALE non-Archaeplastida. La boîte rouge indique le domaine ELK. b Alignement du domaine PBL-Red. Toutes les séquences Rhodophyta non-KNOX possèdent un domaine PBL avec une faible homologie MEINOX. c Alignement du domaine PBL-Chloro. Cyanophora_paradox_20927.63 est inclus pour comparaison. Picocystis_salinarum_02499 est un membre fondateur de la classe GLX avec un domaine PBL-Chloro. d Comparaison entre les domaines PBL. La rangée supérieure montre le consensus réalisé à partir de l’alignement de (a), (b), et (c) combinés et les séquences de consensus inférieures sont recueillies à partir des alignements individuels présentés dans (a), (b), et (c)

GSP1 partage une homologie PBC distante avec d’autres séquences du groupe non-KNOX dans Viridiplantae

Une question restante était l’évolution des séquences non-KNOX de Chlorophyta qui manquaient apparemment d’une homologie PBC. Pour découvrir une homologie même lointaine, nous avons comparé les domaines PBL nouvellement définis avec les séquences de Chlorophyta par BLAST (valeur E de coupure de 1E-1) et alignements de séquences multiples. Cette recherche a permis de recueillir trois séquences TALE de prasinophytes et une séquence TALE de charophyte qui possédaient un motif MEINOX et un domaine PBL putatif ; cependant, elles présentaient une très faible identité de séquence entre elles (Fig. 3c). Une recherche plus poussée utilisant ces quatre séquences a identifié 11 séquences non-KNOX supplémentaires. Neuf d’entre elles ont été regroupées en deux alignements, l’un incluant les homologues de GSP1 et l’autre combinant la plupart des séquences de prasinophytes (fichier additionnel 3 : figure S3). Les deux séquences restantes (Picocystis_salinarum_04995 et Klebsormidium_flaccidum_00021_0250) ont montré une homologie avec une séquence PBX-Red de Chondrus cruentum (ID:41034) dans une extension de ~ 200 aa-long au-delà du domaine PBL, suggérant leur ascendance PBX-Red (un autre cas potentiel de transferts horizontaux ; Fichier additionnel 3 : Figure S4). Toutes les séquences Chlorophyta non-KNOX qui portent les domaines d’homologie PBL ont été classées comme GLX (GSP1-like homeobox) en reconnaissance de la protéine GSP1 de Chlamydomonas comme le premier membre caractérisé de cette classe .

La classe BELL des plantes est-elle homologue à la classe GLX de Chlorophyta ?

La classe BELL est la seule classe non-KNOX chez les plantes terrestres, partageant un domaine POX (Pré-homéobox) (PF07526) et manquant d’un domaine PBL identifiable. Le génome de K. flaccidum, l’un des deux génomes disponibles chez le charophyte à partir duquel la plante terrestre a émergé, contenait trois séquences non-KNOX, toutes possédant un domaine PBL (Fig. 3, Additional file 3 : Figures S3, S4). Le deuxième génome de charophyte de Chara braunii contenait un homologue putatif de BELL qui semble être tronqué pour les séquences N-terminales en dehors de son homéodomaine C-terminal, probablement en raison du modèle de gène incomplet. Par conséquent, l’absence d’homologie PBL dans la classe BELL des plantes semble être due à la divergence ou à la perte de domaine d’une ancienne classe de charophyte qui avait une homologie PBL. Nous avons trouvé un intron à la position de l’homéodomaine 24(2/3) d’un homologue GLX de K. flaccidum, qui a été précédemment identifié comme étant spécifique à la classe BELL des plantes (Additional file 3 : Figure S5), ce qui suggère que la classe BELL des plantes a évolué à partir d’un gène GLX ancestral. Un plus grand échantillonnage de taxons chez les charophytes est nécessaire pour confirmer cette inférence.

Deux paralogues non-KNOX de Chlorophyta hétérodimerisent avec les homologues KNOX

Même avec notre recherche d’homologie itérative sensible, nous n’avons pas pu identifier une homologie PBC/PBL dans environ la moitié des séquences non-KNOX de Chlorophyta. Puisque la plupart des génomes de Chlorophyta possèdent un homologue GLX et une séquence non-KNOX sans le domaine d’homologie PBL, nous référons ces dernières collectivement à la classe B (fichier additionnel 3 : figure S6). Des exceptions ont été trouvées dans un clade de prasinophytes (classe Mamiellophyceae), dont les six génomes de haute qualité contiennent tous deux séquences non-KNOX dépourvues du domaine d’homologie PBL. Néanmoins, ces séquences non-KNOX formaient deux groupes, l’un plus conservé et l’autre moins conservé et polyphylétique, désignés respectivement comme les classes Mam-A et Mam-B (fichier additionnel 3 : Figures S7, S8). Compte tenu de l’évolution génomique réductrice des Mamiellophyceae , la classe Mam-A conservée pourrait être dérivée d’une classe GLX ancestrale.

Deux classes non-KNOX divergentes chez les Chlorophyta ont conduit à une question critique sur leurs réseaux dyadiques. Des études antérieures avaient montré que les hétérodimères de TALE nécessitaient une interaction entre les domaines MEIS et PBC chez les animaux et entre les domaines KNOX et PBL chez Chlamydomonas . Il a donc été prédit que tous les TALE de Glaucophyta et Rhodophyta forment des hétérodimères via leurs domaines d’homologie KNOX et PBL. En revanche, il restait à tester si les TALE de Chlorophyta dépourvus de domaine PBL peuvent former des hétérodimères avec d’autres TALE.

Pour caractériser le réseau d’interaction des protéines de la classe TALE chez les Chlorophytes, nous avons sélectionné trois espèces de prasinophytes pour des essais d’interaction protéine-protéine : deux espèces contenant des gènes Mam-A et Mam-B (Micromonas commoda et Ostreococcus tauri), et une autre espèce (Picocystis salinarum), dont le transcriptome contenait une séquence GLX et une séquence Classe-B. Dans ces trois espèces, nous avons constaté que les homologues de KNOX interagissaient avec toutes les protéines non-KNOX examinées dans les classes Mam-A, Mam-B, Classe-B et GLX (Fig. 4a-c). Aucune interaction n’a été observée entre les deux protéines non-KNOX dans aucune des trois espèces (Fig. 4a-c). Comme pour l’hétérodimérisation GLX-KNOX, Mam-A et Mam-B nécessitaient également des domaines supplémentaires en dehors de l’homéodomaine pour leur hétérodimérisation avec les homologues de KNOX (fichier supplémentaire 3 : figure S9). Ces résultats montrent que tous les TALE divergents non-KNOX ont conservé leur activité originale pour former des hétérodimères avec les homologues KNOX. Le réseau d’interaction observé parmi les séquences TALE est résumé dans le fichier supplémentaire 3 : Figure S10.

Les TF TALE s’engagent dans des réseaux d’hétérodimérisation entre les groupes KNOX et non-KNOX. Les constructions appâts conjuguées au domaine de liaison à l’ADN GAL4 (DBD) et les constructions proies conjuguées au domaine d’activation transcriptionnelle GAL4 (AD) sont listées dans le tableau. Les combinaisons de constructions, numérotées de 1 à 8, sont disposées en cales dans le sens des aiguilles d’une montre, en commençant à 9 heures, comme indiqué dans les panneaux -LT. Les paires d’interactions confirmées sont indiquées en caractères gras dans le tableau. La paire laminine et T-Antigen (T-Ag), connue pour être des partenaires d’interaction, a été placée dans le 8e secteur comme contrôle positif. a Essais utilisant les TALE de M. commoda. b Essais utilisant les TALE de O. tauri. c Essais utilisant les TALE de P. salinarum. KNOX-tr désigne la construction KNOX tronquée à l’extrémité N-terminale pour empêcher l’auto-activation. d Des informations détaillées sur les constructions sont fournies dans le fichier additionnel 1 : Tableau S5

L’hétérodimérisation des TALE a évolué tôt dans l’histoire des eucaryotes

Notre découverte de l’homologie PBC chez les Archaeplastidés suggère une ascendance commune des TALES hétérodimérisants entre les Métazoaires et les Archaeplastidés. Elle prédit également que d’autres lignées eucaryotes pourraient posséder des TALEs avec l’homologie PBC. En dehors des animaux, la base de données Pfam ne contient que deux séquences portant le domaine PBC-B, l’une provenant d’une espèce Cryptophyta (Guillardia theta, ID:137502) et l’autre d’une espèce Amoebozoa (Acanthamoeba castillian, ID:XP_004342337) . Nous avons également examiné le groupe Excavata, proche de la racine supposée de la phylogénie eucaryote. Une recherche de deux génomes (Naegleria gruberi et Bodo saltans) a recueilli 12 séquences d’homéoboxes TALE dans N.gruberi, et aucune dans B.saltans, dont nous avons trouvé une avec un domaine d’homologie PBC (ID:78561, Fig. 3a) et une avec une homologie MEIS/KNOX (ID:79931, Additional file 3 : Figure S2). Nous avons recherché d’autres génomes d’Amorphea et avons trouvé l’homologie PBC et l’homologie MEIS/KNOX dans les séquences TALE collectées chez les Apusozoa, Ichtyhosporea, et Choanoflagellata mais pas chez les Fungi (Additional file 3 : Figures S11-S14). Nos données suggèrent que les domaines d’hétérodimérisation – l’homologie PBC et l’homologie MEIS/KNOX – sont apparus tôt dans l’évolution eucaryote et ont persisté tout au long des principales radiations eucaryotes.

L’intronétention soutient l’évolution parallèle des classes de TALE hétérodimériques au cours des radiations eucaryotes

L’omniprésence des TALE dyadiques a soulevé la question suivante : Tous les TALE dyadiques signalés dans cette étude sont-ils les descendants d’une seule dyade ancestrale, ou résultent-ils d’une évolution spécifique à une lignée à partir d’un seul TALE prototypique (proto-TALE) qui ne s’engage pas dans l’hétérodimérisation. Pour sonder l’ascendance profonde, nous avons examiné la rétention d’introns, celle-ci étant considérée comme un caractère préservé depuis longtemps et moins susceptible de se produire par homoplasie (un caractère affiché par un ensemble d’espèces mais non présent chez leur ancêtre commun). Cinq positions d’introns étaient partagées par au moins deux classes de TALE, parmi lesquelles les introns 44/45 et 48(2/3) ont été qualifiés de plus ancestraux puisqu’ils ont été retrouvés dans l’ensemble des Archaeplastida et des Metazoa (fichier additionnel 3 : figure S5).

Les introns 44/45 et 48(2/3) ont montré une distribution exclusive intrigante entre les deux partenaires dyadiques de chaque phylum : l’un possède l’intron 44/45 et l’autre possède l’intron 48(2/3) (Additional file 3 : Figure S5). Ce modèle mutuellement exclusif suggère que deux gènes TALE avec des positions d’intron distinctes existaient au début de la radiation eucaryote. Nous considérons la position de l’intron 44/45 comme la plus ancestrale, étant donné qu’elle était conservée dans la plupart des gènes homéobox non TALE. À cet égard, nous supposons que l’acquisition du 48(2/3) et la perte de l’intron 44/45 ont accompagné un événement précoce au cours duquel le proto-TALE avec l’intron 44/45 a été dupliqué pour générer un second TALE avec l’intron 48(2/3). Étant donné que la position de l’intron 48(2/3) a été trouvée dans les gènes du groupe KNOX/MEIS chez les Viridiplantae et les Metazoa, ainsi que dans les gènes du groupe PBX chez les Rhodophyta et les Cryptophyta, nous pouvons supposer que les TALE dupliqués sont apparus tôt et se sont diversifiés pour établir des configurations hétérodimériques spécifiques des lignées au cours des radiations eucaryotes. Alternativement, la position de l’intron 48(2/3) dans l’homéodomaine TALE pourrait avoir été acquise plusieurs fois au cours des radiations eucaryotes.

Étant donné que les TALE hétérodimériques ont évolué d’une manière spécifique à la lignée, nous avons demandé à quoi ressemblait le proto-TALE au moment où il a subi une duplication. Les observations suivantes suggèrent que le proto-TALE était une protéine homodimérique. Premièrement, les domaines d’homologie PBC des protéines de la classe PBX/GLX identifiées chez les Archaeplastides comprennent le motif MEINOX qui a été défini à l’origine pour sa similarité avec les domaines d’homologie MEIS/KNOX (Fig. 3). Deuxièmement, les séquences PBX-Glauco possèdent l’homologie ELK dans leur domaine PBL (Fig. 3), qui s’aligne bien avec les domaines ELK des séquences de classe KNOX chez les Viridiplantae (Additional file 3 : Figure S15). Par conséquent, le motif MEINOX et l’homologie ELK à travers les groupes KNOX et PBX hétérodimérisants soutiennent l’origine commune des groupes TALE hétérodimérisants à partir d’un seul TALE par duplication suivie d’une sous-fonctionnalisation.