La colocalisation haute résolution à molécule unique de Cy3 et Cy5 attachés à des macromolécules mesure les distances intramoléculaires à travers le temps

Matériaux et méthodes

Préparation de l’ADN duplex. Pour fabriquer les molécules d’ADN duplex de 30 pb, deux oligonucléotides ayant la séquence et les modifications suivantes ont été hybridés (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). L’oligonucléotide 5′-GGGTATGGAGATTTTTAGCGGAGTGACAGC-3′ a été marqué avec Cy5 à son extrémité 5′ et avec Cy3 à son extrémité 3′. L’oligonucléotide complémentaire a été marqué à la biotine à ses deux extrémités.

Expression et purification de la protéine. Le gène de la protéine fluorescente jaune (YFP) dans le plasmide p2Bac/pFastBac-YFP-M5-CaM (un don de H. Lee Sweeney, Université de Pennsylvanie, Philadelphie) a été supprimé par PCR. Le plasmide p2Bac/pFastBac-M5-CaM résultant code pour la myosine V de poulet qui est tronquée à Glu-1099. Une fermeture éclair de leucine suit la bobine spiralée native pour assurer la dimérisation. Pour faciliter la purification, la protéine myosine V a été étiquetée N-terminalement avec une étiquette FLAG (DYKDDDDK). Deux baculovirus recombinants ont été générés pour l’expression de la protéine dans les cellules Sf9. L’un codait la myosine V tronquée et la calmoduline de Drosophila melanogaster dérivée du plasmide p2Bac/pFastBac-M5-CaM. Le second virus codait la chaîne légère essentielle humaine dérivée du plasmide p2Bac/pFastBac-ELC. Les deux virus ont été utilisés pour la coinfection de cellules Sf9. La protéine a été exprimée et purifiée comme décrit par Sweeney et al. (20).

Marquage et échange de la calmoduline. La calmoduline a été exprimée et marquée avec Cy3 ou Cy5 comme suit : Une cystéine unique a été introduite dans la calmoduline de l’oursin au moyen de la mutation Q143C. Cette calmoduline a été exprimée dans Escherichia coli et purifiée comme décrit dans la réf. 21. La calmoduline a été marquée avec des solutions mères de Cy3-maléimide ou Cy5-maléimide (Amersham Biosciences) (dans le DMSO) à un rapport molaire de 1,4 pendant 20 minutes. L’excès de colorant a été éliminé par filtration sur gel dans un tampon d’échange (ci-dessous), suivi d’une absorption hydrophobe pendant une nuit sur des BioBeads (Bio-Rad). L’incorporation du marqueur était de 102 % pour Cy3-calmoduline et de 75 % pour Cy5-calmoduline. Les aliquots ont été conservés à -80°C.

L’échange de calmoduline marquée sur la myosine V a été réalisé comme décrit mais avec quelques modifications (22). La myosine V (150 nM) a été incubée avec 0,7 nM de calmoduline marquée au Cy3 et 0,8 nM de calmoduline marquée au Cy5 dans un tampon d’échange (25 mM KCl/20 mM imidazole HCl, pH 7,4/2 mM MgCl2/1 mM EGTA) à 22°C pendant 2 min. Pour échanger les calmodulines, 0,9 mM CaCl2 a été ajouté et le mélange a été incubé à 22°C pendant 5 min. La réaction a été éteinte avec de l’EGTA 7 mM. Le mélange réactionnel a été appliqué sur un dispositif d’ultrafiltration Nanocep 100K MWCO (Pall) et lavé trois fois avec des volumes égaux d’AB (ci-dessous) pour purifier la myosine V de l’excès de calmoduline.

Préparation de la cellule à écoulement. La cellule d’écoulement a été construite avec une lame de microscope en verre et des lamelles couvre-objet hautement réfringentes en NLAF21 (VA Optical Labs, San Anselmo, CA) maintenues ensemble par des morceaux de scotch double face.

Pour les expériences sur la myosine V, 15 μl de biotine-BSA (1 mg-ml-1) ont été incubés dans la cellule à flux pendant 2 min, après quoi 30 μl de tampon AB (25 mM KCl/25 mM imidazole HCl, pH 7,4/1 mM EGTA/4 mM MgCl2/10 mM DTT/1 mg-ml-1 BSA) ont été passés dans la cellule à flux pour la laver. Quinze microlitres de 0,5 mg/ml de NeutrAvidine (Molecular Probes) ont été ajoutés à la cellule et laissés à incuber pendant 2 min, après quoi un autre lavage a été effectué avec le tampon AB. La cellule à écoulement a été incubée avec 15 μl de filaments d’actine de phalloïdine biotinylée (250 nM) pendant 5 min, puis un lavage de 100 μl avec du tampon AB. Enfin, la cellule a été chargée avec 20 μl de tampon d’imagerie comprenant de la myosine V échangée contre de la calmoduline, 5 μM de calmoduline, 300 nM d’ATP, un système de régénération de l’ATP (0,1 mg-ml-1 de créatine phosphokinase/1 mM de créatine phosphate), et 0,5 % (vol/vol) de Triton-X 100 pour réduire les liaisons non spécifiques. La cellule a été scellée avec de la graisse à vide et imagée immédiatement. La concentration finale du moteur a donné lieu à une actine peu décorée et a donc permis une analyse des molécules de myosine V uniques.

Pour les expériences sur l’ADN, la biotine-BSA et la NeutrAvidine ont été chargées de la même manière que pour les expériences sur la myosine V, mais les lavages ont été effectués avec le tampon T50 (10 mM Tris, pH 8,0/50 mM NaCl). Une fois que la cellule à flux a été recouverte de NeutrAvidin, 15 μlof de dsDNA (30 nM) dans le tampon T50 avec 1 mg-ml-1 de BSA ont été introduits et incubés pendant 2 min, après quoi 100 μl de tampon d’imagerie ont été introduits. La cellule d’écoulement a ensuite été scellée avec de la graisse à vide et rapidement imagée. La décoration résultante des molécules d’ADN sur la surface était suffisamment clairsemée pour que les spots fluorescents de différentes molécules se chevauchent rarement.

Configuration du microscope. Le microscope de fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) a été configuré comme décrit dans la réf. 8, avec quelques modifications (Fig. 5, qui est publiée en tant qu’information complémentaire sur le site Web des PNAS). Les faisceaux des sources d’excitation à 532 nm (Coherent, Santa Clara, CA) et 633 nm (JDS Uniphase, San Jose, CA) ont été combinés par un miroir dichroïque et étendus à un diamètre de 7 mm. Ces sources ont été focalisées (distance focale = 500 mm) sur le plan focal arrière d’un objectif TIRF Olympus 1,65 NA ×100 au moyen d’un dichroïque à ligne laser sur une translation linéaire DeepL qui permet le fonctionnement du microscope en mode épifluorescence ou TIRF. L’objectif était positionné sous une translation piézoélectrique nanoDeepL en boucle fermée, à deux axes, équipée de capteurs capacitifs pour la mesure de la position (Physik Instrumente, Auburn, MA). La lumière réfléchie sortant de l’ouverture arrière de l’objectif était dirigée sur une photodiode à quadrant pour fournir un signal à une boucle de rétroaction de mise au point qui fixait la distance entre l’objectif et l’échantillon avec un actionneur électrostrictif (Newport, Fountain Valley, CA). L’émission de fluorescence était collectée par l’objectif, passait à travers deux filtres coupe-bande à couche mince StopLine (Semrock, Rochester, NY), un pour chaque source d’excitation, et était transmise à travers un appareil à double vue qui permettait l’imagerie simultanée des canaux Cy3 et Cy5 sur une seule caméra EMCCD iXon DV 887 (Andor Technology, Belfast, Irlande). Toutes les données ont été imagées avec un temps d’intégration de 0,5 seconde. La diaphonie entre les deux canaux (10%) biaise probablement les mesures de distance vers des valeurs plus petites. Notre erreur expérimentale la rend toutefois indétectable, comme le montrent les simulations de Monte Carlo dans lesquelles 100 paires d’images modélisées de fluorophores uniques séparés de 10 nm ont été créées et analysées de la même manière que pour les données ADN (décrites ci-dessous). Les images simulées des fonctions d’étalement du point de fluorescence ont été calculées en générant une distribution d’intensité gaussienne 2D intégrée avec un arrière-plan constant auquel on a ajouté un bruit de fond. Les pics simulés avaient les mêmes dimensions et le même rapport signal/bruit que les pics réels. Les données simulées avec 10% de diaphonie et les données simulées sans diaphonie sont indiscernables par un test de Kolmogorov-Smirnov (N 1 = 100, N 2 = 100, p > 0,05).

Analyse des données. Une cartographie d’enregistrement des canaux Cy3 et Cy5 a été réalisée avec des fiduciaires constitués de billes TransFluoSphere de 100 nm (Molecular Probes). Elles ont été excitées à 532 nm et émettent avec un large spectre d’émission. La bille était détectable dans nos deux canaux. Nous avons localisé une seule bille associée au couvre-objet, et avec notre platine piézoélectrique, nous l’avons étagée avec une précision nanométrique dans un motif de grille (avec un espacement de 0,5-μm), en prenant une image à chaque arrêt. Le résultat final était une pile de 312 images qui montre la perle dans les deux canaux à différentes positions (Fig. 1a ).