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La promesse de thérapies améliorées grâce à des études moléculaires de la régulation de l’hémoglobine fœtale

Bien que les approches thérapeutiques non ciblées discutées ci-dessus aient été prometteuses et aient connu un certain succès dans l’induction de l’HbF en milieu clinique, une meilleure compréhension mécaniste des fondements moléculaires nécessaires au passage normal de l’hémoglobine du fœtus à celle de l’adulte est très prometteuse pour permettre le développement d’approches plus efficaces et spécifiquement ciblées pour l’induction de l’HbF. Au cours des décennies qui ont suivi le clonage moléculaire des gènes de la globine, divers facteurs de transcription jouant un rôle dans la régulation des gènes de la globine ont été identifiés (Cantor et Orkin 2002). Il s’agit notamment de facteurs de transcription tels que GATA1, KLF1 et SCL/ TAL1. Cependant, l’étude du rôle de ces facteurs dans la régulation du gène de la globine a été compliquée par le rôle général de ces facteurs dans la différenciation et leurs rôles pléiotropiques en tant que régulateurs de la régulation des gènes de la globine et des érythroïdes. Aucun de ces facteurs ne semblait être un régulateur spécifique du passage de l’hémoglobine fœtale à l’hémoglobine adulte. Il a fallu près de trois décennies à partir du clonage initial des gènes de la globine avant que les régulateurs spécifiques de ce processus ne soient identifiés.

Des indices importants sur l’identité de ces facteurs sont apparus lors de l’étude de la variation génétique humaine naturelle. Un certain nombre de groupes ont recherché la base de la variation génétique commune dans les niveaux d’HbF en utilisant des études d’association ciblées et à l’échelle du génome (GWAS) (Menzel et al. 2007 ; Thein et al. 2007 ; Lettre et al. 2008 ; Uda et al. 2008). Ces études ont permis d’identifier trois loci génomiques abritant des variants communs qui influencent les taux d’HbF. Il s’agissait d’une région du chromosome 2 située dans le gène BCL11A, d’une région intergénique entre les gènes HBS1L et MYB sur le chromosome 6, et de variants dans le locus de la β-globine sur le chromosome 11. Des études récentes qui ont cartographié plus finement ces variants génétiques suggèrent que >50% de la variation des taux d’HbF peut être expliquée par une variation commune à ces trois loci (Galarneau et al. 2010). Bien que l’on pense que les niveaux d’HbF ont une composante génétique héritable de l’ordre de ∼80%, il est important de garder à l’esprit que la variation génétique additive trouvée à partir de variants génétiques communs ignore les interactions génétiques potentielles d’ordre supérieur qui peuvent ne pas être détectées et donc la mesure dans laquelle les niveaux d’HbF sont génétiquement déterminés reste à explorer dans des études futures (Zuk et al. 2012).

L’observation initiale de variants associés aux niveaux de HbF au sein du facteur de transcription à doigts de zinc BCL11A a conduit à une première étude qui a poursuivi l’hypothèse selon laquelle BCL11A pourrait être un régulateur de l’expression de HbF (Sankaran et al. 2008). Des travaux antérieurs avaient suggéré que BCL11A était un régulateur transcriptionnel critique impliqué dans la lymphopoïèse B et la neurogenèse (Sankaran et al. 2010). Les niveaux de protéine BCL11A semblaient être en corrélation avec le stade de développement de l’expression, de sorte que les cellules érythroïdes définitives primitives et fœtales du foie qui exprimaient des niveaux élevés de γ-globine, avaient une expression faible ou absente des formes complètes de BCL11A. Ce résultat suggère que le produit de ce gène agit comme un répresseur des gènes de la γ-globine. Pour tester directement cette hypothèse, une réduction de BCL11A à l’aide d’ARN à courte épingle à cheveux (shRNA) a été réalisée dans des progéniteurs érythroïdes adultes primaires et l’expression de la γ-globine a pu être induite de manière robuste par une telle réduction. Le degré d’induction de la γ-globine semble être lié à l’ampleur du knockdown de BCL11A. Il est intéressant de noter que des perturbations majeures de l’érythropoïèse n’ont pas semblé se produire malgré la forte induction de la γ-globine observée. Des études ultérieures ont montré des résultats similaires lors de l’élimination de l’expression de BCL11A en utilisant des shRNA (Borg et al. 2010 ; Zhou et al. 2010 ; Wilber et al. 2011). Il a également été démontré que BCL11A interagit directement avec la chromatine au niveau du locus de la β-globine humaine dans les cellules érythroïdes primaires et qu’il semble agir dans le cadre d’un complexe avec le facteur de transcription GATA1 et le complexe de remodelage et de répression de la chromatine NuRD (Sankaran et al. 2008). Il est intéressant de noter que le complexe NuRD contient les HDAC 1 et 2, dont il a été suggéré qu’elles sont les HDAC critiques nécessaires à l’extinction de HbF (Bradner et al. 2010). En outre, il a été suggéré que le facteur de transcription SOX6 peut coopérer avec BCL11A pour aider à faire taire les gènes de la γ-globine chez les humains et il peut être essentiel pour lier le promoteur proximal de ces gènes de globine (Xu et al. 2010).

Bien que la commutation de l’hémoglobine dans les modèles de souris, même ceux hébergeant un transgène du locus β-globine humain, semble diverger de l’ontogénie normale de l’expression de la globine observée chez l’homme, un rôle conservé au cours de l’évolution de BCL11A dans l’extinction et la commutation des gènes de la globine a été démontré chez la souris (Sankaran et al. 2009 ; McGrath et al. 2011). Les souris dépourvues de BCL11A semblent avoir une érythropoïèse normale, mais ne parviennent pas à réduire complètement au silence les gènes de la globine embryonnaire dans les cellules érythroïdes définitives et permettent une certaine expression persistante de la γ-globine lorsque le locus de la β-globine humaine intact est présent. Ces résultats renforcent l’importance de BCL11A comme médiateur critique de la commutation des globines chez les mammifères. Bien que cette première étude ait porté sur le rôle de BCL11A dans le processus de développement du changement de globine chez la souris (Sankaran et al. 2009), une étude plus récente a utilisé l’inactivation conditionnelle de BCL11A pour montrer que l’inactivation inductible peut entraîner une induction robuste et similaire du gène de la γ-globine, comme cela se produit lorsque l’inactivation a lieu à des moments plus précoces (Xu et al. 2011). En outre, bien qu’il existe une régulation différentielle des gènes de la globine entre les humains et les souris, l’inactivation de BCL11A s’est avérée suffisante pour améliorer les caractéristiques hématologiques et pathologiques observées dans les modèles murins de la drépanocytose, fournissant une preuve de principe importante pour l’efficacité potentielle du ciblage de BCL11A pour induire l’HbF (Xu et al. 2011).

Les mécanismes exacts par lesquels BCL11A réduit au silence l’expression du gène de la γ-globine restent flous. Une étude récente suggère que cela peut être médié à la fois par des interactions avec des facteurs de transcription, tels que SOX6 qui se lient à la chromatine au niveau des promoteurs proximaux de la γ-globine, ainsi que par des interactions à longue portée avec une variété de régions tout au long du cluster de gènes de la β-globine (Xu et al. 2010). Lorsque BCL11A est absent, la conformation du locus de la β-globine change de telle sorte que l’amplificateur en amont, connu sous le nom de région de contrôle du locus, est juxtaposé aux gènes de la γ-globine activés sur le plan transcriptionnel. Un phénomène similaire se produit lorsque les cellules sont traitées avec des inhibiteurs d’HDAC qui induisent l’expression du gène de la γ-globine (Bradner et al. 2010). Cependant, il n’est pas clair si ces altérations conformationnelles sont directement médiées par BCL11A ou si ces altérations se produisent secondairement à l’effet inducteur de HbF de l’inhibition de BCL11A (ou HDAC). Néanmoins, ces résultats appuient fortement l’idée que BCL11A semble jouer un rôle direct dans l’inhibition de l’expression de la γ-globine dans le locus de la β-globine. En cartographiant une variété de délétions au sein du locus de la β-globine humaine qui aboutissent soit à la δβ-thalassémie, avec des augmentations modestes de l’HbF et un certain déséquilibre résiduel des chaînes de globine, soit à l’HPFH, avec des augmentations robustes de l’HbF et une synthèse équilibrée des chaînes de globine, il a été démontré qu’une région de N3-kb en amont du gène de la δ-globine est nécessaire à l’extinction des gènes de la γ-globine (Fig. 2) (Sankaran et al. 2011c). Il est intéressant de noter que cette région abrite des sites de liaison pour BCL11A, ainsi que ses partenaires tels que GATA1 et HDAC1. Il convient de noter que cette région a également été impliquée de manière indépendante comme étant importante pour l’extinction de la γ-globine par le biais d’études sur la délétion de la thalassémie de Corfu chez les humains (Chakalova et al. 2005). Cette étude fournit un aperçu mécanistique important sur la façon dont BCL11A fonctionne pour faire taire HbF et renforce l’importance des mutations humaines naturelles pour comprendre ce processus de développement qui est unique à l’homme (Fig. 2) (Sankaran et al. 2011c).

Au vu de ces résultats, BCL11A est susceptible d’être une cible thérapeutique importante. Le fait que son inactivation induise l’HbF sans entraîner de perturbation majeure de l’érythropoïèse est très prometteur, même si l’on sait qu’elle a des effets importants dans d’autres lignées comme les lymphocytes B, ce qui souligne l’importance de la modélisation et de l’analyse in vivo dans le cadre des efforts en cours pour cibler BCL11A pour l’induction de l’HbF. Des études supplémentaires explorant les mécanismes d’action par lesquels BCL11A fonctionne pourraient conduire à des approches meilleures et plus spécifiquement ciblées pour l’induction du HbF (Sankaran et al. 2011c). SOX6 peut également être une cible potentiellement prometteuse pour l’induction de l’HbF (Xu et al. 2010), bien qu’il soit connu pour être nécessaire à une érythropoïèse normale (Dumitriu et al. 2006). Cependant, un patient a été signalé avec une perturbation hétérozygote de SOX6 qui ne présentait pas de niveaux élevés de HbF, ce qui suggère que le gène SOX6 peut avoir un mécanisme de compensation de dosage ou qu’il peut y avoir un seuil particulier nécessaire pour réduire l’expression de ce gène pour avoir une induction robuste de HbF (Sankaran et al. 2011a). Cela suggère qu’il peut y avoir des limites à considérer SOX6 comme une cible potentielle d’induction de la FHB.

A la suite des premières études sur BCL11A, deux études ont suggéré que l’expression de BCL11A semble être contrôlée par le facteur de transcription spécifique aux érythroïdes KLF1 en utilisant des approches indépendantes et complémentaires. Dans une étude, une souris avec un allèle hypomorphe de KLF1 a entraîné une augmentation de l’expression de la globine embryonnaire et des souris transgéniques avec le locus de la β-globine humaine ont montré une expression persistante de la γ-globine (Zhou et al. 2010). Par conséquent, les enquêteurs ont testé si la même régulation pouvait se produire dans les cellules érythroïdes humaines primaires et pouvaient montrer un lien similaire en utilisant des approches shRNA. Les chercheurs ont ensuite montré que cet effet se produit à la fois par des effets directs de KLF1 au niveau du locus de la β-globine, mais aussi par des effets indirects médiés par une expression réduite de BCL11A lors du knockdown de KLF1. Cette découverte a montré que KLF1 était un régulateur transcriptionnel positif direct de l’expression de BCL11A. Un deuxième groupe a examiné la base génétique d’une forme non liée de HPFH qui a été suggérée comme résultant d’une mutation faux-sens de KLF1 dans cette famille (Borg et al. 2010). Les chercheurs ont pu montrer, en utilisant des cellules primaires de ces patients et de témoins non affectés, que l’effet observé était en partie attribuable à un effet de silencieux de KLF1 sur BCL11A. Une zone d’incertitude permanente concerne les phénotypes humains observés dans divers cas de mutations de KLF1. Bien que dans le rapport initial, tous les receveurs de la mutation faux-sens présentaient des élévations de l’expression de l’HbF, il convient de noter que celle-ci variait en fait entre 3 % et 19 % des taux d’hémoglobine totale. En outre, d’autres rapports de mutations hétérozygotes de KLF1 chez l’homme montrent soit une perturbation concomitante de l’érythropoïèse, soit peu d’effet sur l’expression de l’HbF (Arnaud et al. 2010 ; Satta et al. 2011). Des études plus récentes suggèrent que les variants rares de KLF1 sont effectivement associés à des élévations de l’HbF, mais cela ne semble pas se produire de manière constante ou dans la même mesure même avec des mutations similaires (Gallienne et al. 2012). La base de cette variation reste à déterminer et il sera important de mieux comprendre les mécanismes par lesquels KLF1 agit, à la fois directement et indirectement, pour affecter l’expression de HbF. Cela sera essentiel pour tout travail futur visant à cibler KLF1 pour l’induction de HbF, en particulier si les effets indésirables d’une telle inhibition sur la différenciation érythroïde doivent être évités. Cependant, étant donné la spécificité de KLF1 au sein de la lignée érythroïde et si l’activité de régulation du gène de la globine de KLF1 pouvait être spécifiquement ciblée, il devrait toujours être considéré comme un candidat pour induire l’HbF.

En plus des variantes génétiques communes identifiées dans BCL11A associées aux niveaux d’HbF chez l’homme, les études GWAS ont montré qu’il existait des variantes sur le chromosome 6 intergénique entre les gènes HBS1L et MYB qui semblent avoir un effet spectaculaire sur les niveaux d’HbF chez l’homme (Menzel et al. 2007 ; Thein et al. 2007 ; Lettre et al. 2008 ; Uda et al. 2008). Il est important de comprendre le mécanisme d’action par lequel ces variants entraînent des modifications des taux d’HbF, car les variants génétiques de ce locus semblent avoir un effet sur la morbidité clinique des β-hémoglobinopathies aussi important, voire plus important, que les variants du locus BCL11A (Galanello et al. 2009 ; Nuinoon et al. 2010). Il est intéressant de noter que cette région contient une variété d’éléments régulateurs qui ont été suggérés comme ayant un rôle important dans la régulation de l’expression de MYB dans les progéniteurs érythroïdes (Mukai et al. 2006 ; Wahlberg et al. 2009 ; Stadhouders et al. 2011). Bien que la surexpression de HBS1L ne semble pas affecter l’expression de la γ-globine dans les cellules érythroleucémiques K562, la surexpression de MYB semble affecter le niveau de γ-globine produit dans ces cellules (Jiang et al. 2006). De plus, les cultures de progéniteurs érythroïdes primaires d’humains ayant une expression plus élevée de HbF présentaient plus souvent une expression diminuée de MYB (Jiang et al. 2006).

En donnant suite à l’observation clinique classique selon laquelle les patients atteints d’une trisomie du chromosome 13 présentent un retard dans le passage de l’hémoglobine du fœtus à l’adulte et continuent à avoir une expression persistante de HbF (Huehns et al. 1964 ; Sankaran et Sapp 2012), des études récentes ont apporté des preuves supplémentaires du rôle de MYB dans la régulation de l’expression de HbF. En cartographiant finement et en effectuant une analyse génomique intégrative des gènes dans une région du chromosome 13 impliquée comme étant nécessaire à l’élévation de l’HbF observée chez les patients atteints de trisomies partielles du chromosome 13, on a découvert que deux petites molécules d’ARN ∼22 nucléotides étaient les meilleures candidates pour exercer une telle activité, les microARN 15a et 16-1 (Sankaran et al. 2011b). La surexpression de ces microARN dans des cellules érythroïdes adultes primaires en culture a entraîné une augmentation de la production de γ-globine. En examinant les cibles de ces microARN, il a été noté qu’une cible majeure dans les cellules érythroïdes était MYB. Le knockdown direct de MYB dans les progéniteurs érythroïdes adultes primaires a entraîné des augmentations spectaculaires de la production de γ-globine (Sankaran et al. 2011b), reliant cette observation historique d’un syndrome d’aneuploïdie humaine rare aux travaux plus récents examinant les mécanismes moléculaires régulant les niveaux de HbF.

Le mécanisme par lequel MYB peut agir pour réguler les niveaux de HbF reste peu clair. Cela peut être dû à un effet sur la cinétique de l’érythropoïèse ou alternativement peut également se produire en raison d’un effet direct dans le locus β-globine (Higgs et Wood 2008). Des travaux supplémentaires seront nécessaires pour explorer de tels mécanismes et sont très prometteurs dans les tentatives de ciblage thérapeutique de cette molécule pour l’induction de l’HbF. On craint que le ciblage de MYB puisse avoir des effets secondaires indésirables, notamment en raison du rôle pléiotropique de MYB dans l’hématopoïèse (Emambokus et al. 2003 ; Carpinelli et al. 2004). Cependant, des travaux récents suggèrent que de telles stratégies pourraient être prometteuses, car l’inhibition partielle de Myb chez la souris a eu peu d’effet sur l’hématopoïèse normale in vivo tout en bloquant de façon spectaculaire la progression des leucémies (Zuber et al. 2011a). Par conséquent, l’inhibition partielle de MYB pourrait être une stratégie prometteuse pour l’induction de l’HbF. L’additivité des effets des variants dans la région intergénique HBS1L-MYB ainsi que des variants au locus BCL11A (Lettre et al. 2008 ; Galanello et al. 2009 ; Nuinoon et al. 2010) suggère que le ciblage de ces deux voies ensemble pourrait produire des effets encore plus robustes que le ciblage de l’une ou l’autre voie seule.

Bien que les régulateurs de la régulation de l’HbF discutés ci-dessus aient été trouvés par des études génétiques humaines, confirmant ainsi leur pertinence in vivo chez l’homme, une variété d’autres molécules ont également été suggérées pour jouer des rôles dans la régulation du gène de la γ-globine par diverses études utilisant des approches de culture cellulaire ou avec des modèles de souris (tableau 1). Ces molécules seront discutées ci-dessous. Il est important de garder à l’esprit qu’il existe des limites pour la plupart des systèmes expérimentaux actuellement disponibles utilisés pour étudier la régulation du gène de la γ-globine. Les cellules érythroïdes humaines primaires semblent être permissives aux manipulations qui permettent d’augmenter la production de γ-globine, ce qui n’est pas toujours pertinent chez l’homme in vivo. En outre, bon nombre des stimuli connus pour induire la production de γ-globine in vivo chez l’homme, y compris divers types d’érythropoïèse de stress et le traitement à l’hydroxyurée, ne fonctionnent pas pour induire la production de γ-globine dans les modèles de souris humanisées (Pace et al. 1994 ; Sankaran et al. 2009) soulignant une limitation importante pour l’interprétation des résultats négatifs dans ce système expérimental. Ainsi, il faut faire preuve de prudence lors de l’interprétation de résultats expérimentaux non soutenus par des preuves provenant d’études génétiques humaines ou d’études réalisées chez l’homme ou les primates in vivo.

En examinant les protéines qui se lient aux éléments répétés directs trouvés dans le promoteur des gènes de la γ-globine, les récepteurs orphelins d’hormones nucléaires TR2 et TR4 ont été suggérés comme jouant un rôle de répresseurs de l’expression des gènes de la γ-globine (Tanabe et al. 2002, 2007 ; Cui et al. 2011). Paradoxalement, la surexpression de TR2 et TR4 dans des modèles de souris transgéniques entraîne une expression élevée de la γ-globine et, lorsqu’elle est surexprimée dans des modèles de souris drépanocytaires, peut entraîner une amélioration partielle des symptômes hématologiques et pathologiques de ces souris (Campbell et al. 2011). Les mécanismes qui sous-tendent ces observations et la pertinence de la régulation du gène de la globine chez l’homme restent à établir pour TR2 et TR4. En outre, le récepteur nucléaire COUP-TFII, une hormone nucléaire orpheline, a également été suggéré pour se lier aux répétitions directes et réprimer le promoteur de la γ-globine chez l’homme (Filipe et al. 1999). En utilisant des cultures in vitro de cellules érythroïdes adultes primaires, il a été montré que les cytokines telles que le SCF semblent réguler à la baisse l’expression et l’occupation chromatinienne de COUP-TFII au locus de la β-globine, ce qui entraîne une augmentation de l’expression de la γ-globine (Aerbajinai et al. 2009). En outre, la régulation négative directe de COUP-TFII à l’aide de petits ARN interférents (siRNA) pourrait entraîner une augmentation de la production de γ-globine (Aerbajinai et al. 2009). D’autres études sur le rôle de COUP-TFs dans la régulation de l’HbF seront nécessaires pour mieux comprendre son rôle physiologique chez l’homme.

Des études récentes ont également suggéré un rôle pour le gène nommé ami de PRMT1 (FOP1) dans la répression de l’expression du gène de la γ-globine (van Dijk et al. 2010). Le knockdown de FOP1 entraîne une expression élevée de HbF dans les cellules érythroïdes adultes humaines en culture. Il a été suggéré que cela était médié par une expression réduite de SOX6, dont le knockdown est connu pour entraîner également une augmentation de la production de γ-globine (Xu et al. 2010). Des travaux supplémentaires seront nécessaires pour confirmer ces résultats, comprendre si ce gène a également un rôle dans l’érythropoïèse de manière plus large, et examiner le mécanisme qui sous-tend ces observations.

Certaines études ont également suggéré un rôle pour la protéine sélecteur de stade NF-E4 en tant qu’activateur de l’expression de la γ-globine chez l’homme (Jane et al. 1995 ; Zhao et al. 2006). Il a été suggéré qu’une forme courte de NF-E4 pourrait jouer un rôle dans la répression des gènes de la γ-globine en inhibant la fonction activatrice normale de NF-E4 au niveau du promoteur de ces gènes (Zhou et al. 2004). Ces études ont toutes été basées sur des expériences réalisées sur des cellules en culture et sur la purification biochimique de complexes protéiques à partir de cellules K562. Par conséquent, d’autres travaux seront nécessaires pour confirmer le rôle physiologique de ce gène dans l’expression de la γ-globine et mieux comprendre les mécanismes par lesquels ce complexe pourrait agir pour modifier la régulation des gènes de la globine humaine.