A vaddisznó és a házisertés megkülönböztetése az élelmiszerekben két génloci célzásával valós idejű PCR segítségével

Primer és szonda tervezése
A primer/szonda koncentráció és arány optimalizálása
Keresztreaktivitási vizsgálatok
A különböző kereskedelmi master mixek alkalmazhatóságának szűrése
Robusztusság
Munkatartomány, lineáris tartomány és amplifikációs hatékonyság
A kimutatási határ (LOD) heringspermium DNS-ben és sertés DNS-ben mint háttér-DNS-ben
Megismételhetőség
Vaddisznó és házisertés egyedekből származó minták elemzése

Primer és szonda tervezése

A primer és szonda tervezéséhez olyan polimorfizmusokat választottunk, amelyekről már beszámoltak, hogy lehetővé teszik a vaddisznó és a házisertés megkülönböztetését. Az NR6A1 génben található g.299084751 C > T SNP-vel kezdtük, amelyről kimutatták, hogy összefügg a mellkasi és ágyéki csigolyák számával: a vaddisznók, amelyek homozigóta a g.299084751 C vad típusú allélre, 19 csigolyával rendelkeznek, míg a házisertések, amelyek homozigóta a g.299084751 T-re, 21-23 csigolyával rendelkeznek. Fontanesi és munkatársai tanulmányában ezt az SNP-t használták a vaddisznó és a házisertés megkülönböztetésére PCR-RFLP10 segítségével. Célunk az volt, hogy egy primerpárt tervezzünk a célrégió amplifikálására mind a vaddisznóban, mind a házisertésben, valamint két TaqMan szondát, amelyek a vaddisznó allélra (g.299084751 C), illetve a házisertés allélra (g.299084751 T) specifikusak. A duplex assay lehetővé teszi a vaddisznó és a házisertés egyidejű kimutatását ugyanabban a kútban. Összesen négy forward primert, három reverse primert, négy vaddisznó szondát és egy házisertés szondát terveztünk, és ezeket 21 primer/szonda rendszerré kombináltuk (Chr1a – u, 1. kiegészítő táblázat). A Chr1a primer/szondarendszer a felső, a Chr1b-u primer/szondarendszerek pedig az NR6A1 gén alsó szálát célozták meg. Kísérletsorozatban megvizsgáltuk, hogy a primer/szondarendszerek specifikusak-e a vaddisznóra, vagy keresztreaktivitást mutatnak-e a házisertésfajtákkal/keresztezett fajtákkal. A Chr1a primer/szondarendszer a házisertés és a vaddisznó között ≥ 10,56 ΔCt-értéket eredményezett (2. kiegészítő táblázat). A Chr1i – o primer/szonda rendszerek esetében a ΔCt értékek 8,65 és 11,19 között mozogtak. A Chr1b – h és Chr1p – t primer/próba rendszerek nem eredményezték a fluoreszcenciajel növekedését a házisertésfajták/keresztezések esetében. Mivel a Chr1q primer/szonda rendszer a legalacsonyabb Ct-értéket (24,77; n = 2) eredményezte vaddisznó esetében, teszteltük alkalmazhatóságát egy TaqMan szondával kombinálva a házisertés esetében duplex vizsgálati formátumban (Chr1u primer/szonda rendszer, 1. kiegészítő táblázat). Mivel a Ct-értékek mind a vaddisznó (26,21, n = 2), mind a házisertés (27,90, n = 2) esetében kielégítőek voltak, minden további, a g.299084751 C > T SNP-t célzó PCR-kísérletet a Chr1u primer/szonda rendszerrel végeztünk. A továbbiakban a duplex valós idejű PCR-tesztet assayChr1-nek nevezzük, amely a házisertésre vonatkozó assayChr1D tesztből áll, amely a Chr1f4 elülső primert, a Chr1r2 fordított primert és a Chr1p1D szondát tartalmazza, valamint a vaddisznóra vonatkozó assayChr1W tesztből, amely a Chr1f4 elülső primert, a Chr1r2 fordított primert és a Chr1p4W szondát tartalmazza (ábra). 1A).

Mivel az irodalomból megtudtuk, hogy a megkülönböztető erő egyetlen polimorfizmus megcélzásával valószínűleg nem elegendő, további alkalmas génlokuszt kerestünk. Beugin és munkatársai 20 SNP-t vizsgálva a vaddisznó és a házisertés megkülönböztetésére való alkalmazhatóságukat, a legnagyobb diszkriminációs erőt az rs80864596 (intergenikus, 5. kromoszóma), az rs80796712 (glikogén-szintáz kináz 3-béta, 13. kromoszóma) és az rs81416363 (intergenikus, 9. kromoszóma) SNP-k mutatták11. Ezért ezt a három SNP-t választottuk ki a primer/szondarendszerek tervezéséhez. A g.299084751 C > T SNP-re vonatkozó primer/szondatervezéshez képest más stratégiát követtünk. Ahelyett, hogy az alfajspecifikus bázist a szondában helyeztük volna el, az elő- vagy a hátsó primer 5′ végétől számított utolsó előtti helyen helyeztük el. A specificitás fokozása érdekében szándékos bázis-eltéréseket vezettünk be. Ennek az úgynevezett mismatch amplification mutation assay (MAMA) technikának12,13 az az előnye, hogy meglehetősen költséghatékony, mivel egy és ugyanazon szonda több, a mismatch pozíciójában eltérő primerrel is vizsgálható. Az első kísérletsorozatban az alfajspecifikus bázist hordozó primer 3′ végétől számított 3. vagy 6. pozícióba vezettük be a hibás illeszkedést okozó bázist. Amikor a gímszarvasra, a dámszarvasra és a szikaszarvasra vonatkozó valós idejű PCR-próbákat fejlesztettünk ki14,15,16 , ez a stratégia sikeresnek bizonyult. Jelen vizsgálatban azonban egyik primer/szonda rendszer (Chr5b – d, Chr13b – c, Chr9b – g, Chr9i – n, 1. kiegészítő táblázat) sem tette lehetővé a házisertés és a vaddisznó megkülönböztetését (3. kiegészítő táblázat). A legjobb eredményeket (ΔCt-érték a házisertésfajták/keresztezések és a vaddisznó között ≥5,24) a Chr9j primer/szondarendszerrel kaptuk. Ebben a 9. kromoszómán található rs81416363 SNP-t célzó primer/szondarendszerben a hibás bázis a primer 3′ végétől számított 3. pozícióban helyezkedett el (TTCACG → TTCCCCCG). A specificitás növelése érdekében a primer 3′ végétől számított 4. (TTCACG → TTGCCG, TTACCG, TTTCCG) vagy 5. pozícióba (TTCACG → TACCCG, TCCCCG, TGCCCG) további mismatch bázist vezettünk be. A további hibás illesztések bevezetése sikeresnek bizonyult. A Chr9r primer/primer rendszerrel (1. kiegészítő táblázat) a vaddisznó esetében a legalacsonyabb Ct-értéket (22,09; n = 2) és a legmagasabb ΔCt-értéket (10,52) kaptuk a házisertésfajták/keresztezések és a vaddisznó között (3. kiegészítő táblázat). A vaddisznóra vonatkozó, a 9. kromoszómán található SNP rs81416363-t célzó valós idejű PCR-teszt a Chr9r (Chr9f8, Chr9r12W, Chr9p2) primer/szonda rendszeren alapult.

A következő lépésben a MAMA stratégiát alkalmaztuk a megfelelő, a 9. kromoszómán található SNP rs81416363-t célzó valós idejű PCR-teszt kifejlesztésére a házisertésre. A házisertés-specifikus bázist a primer 5′ végétől számított utolsó előtti bázison, a hibás bázist pedig a 3′ végétől számított 3. pozícióban helyeztük el (primer/szondarendszerek Chr9v – x; Kiegészítő táblázat 1). Egyetlen mismatch bázis bevezetése azonban nem volt elegendő a házisertés és a vaddisznó megkülönböztetéséhez. A hibás illeszkedési bázisok bevezetése a primer 3′ végétől számított 3. és 5. pozícióban (primer/próba rendszerek Chr9y – ag) ≥ 4,83 ΔCt értéket eredményezett. Amikor a hibás illesztések a 3. és 4. pozícióban voltak (primer/próba rendszerek Chr9ah – aj), a ΔCt érték ≥5,85 volt. Az alfajspecifikus bázis mellé három egymást követő mismatch bázis bevezetésével (primer/próba rendszerek Chr9ak – am) a specificitás növelhető volt. A Chr9ak primer/szondarendszer, amelyben a hibás illesztések a 3., 4. és 5. pozícióban voltak (TTCATG → TGGTTG), a legmagasabb ΔCt-értéket eredményezte, ≥9,97-et. Így minden további kísérletet a Chr9ak primer/szondarendszerrel végeztünk. A továbbiakban a 9. kromoszómán található SNP rs81416363-ra irányuló két singleplex próbát assayChr9D-nek nevezzük, amely a Chr9f8 elülső primert, a Chr9r17D fordított primert és a Chr9p2 szondát tartalmazza, valamint assayChr9W-nek, amely a Chr9f8 elülső primert, a Chr9r12W fordított primert és a Chr9p2 szondát tartalmazza (1B. ábra).

A primer/szonda koncentráció és arány optimalizálása

A fent bemutatott eredmények 500 nM és 200 nM (az 1. kromoszómát célzó primer/szonda rendszerek), illetve 200 nM és 100 nM (az 5., 9. és 13. kromoszómát célzó primer/szonda rendszerek) koncentrációval készültek. Ezután megvizsgáltuk, hogy a primer/szonda koncentráció és arány optimalizálásával növelhető-e a valós idejű PCR-próbák specificitása. Az assayChr1 esetében az optimális primer- és szondakoncentráció 1000 nM, illetve 200 nM volt (4. kiegészítő táblázat). Az assayChr9W és az assayChr9D esetében az alfajspecifikus bázist és a nem illeszkedő bázisokat egyaránt tartalmazó primer többlete magasabb ΔCt-értékeket eredményezett a keresztreagáló alfaj és a célfaj között. Az assayChr9W és az assayChr9D legnagyobb szelektivitását 12,5/200/50 nM, illetve 62,5/800/50 nM előprimer/fordított primer/primer/próba koncentrációval értük el.

Keresztreaktivitási vizsgálatok

A következőkben keresztreaktivitási vizsgálatokat végeztünk vaddisznóból, különböző házisertésfajtákból/keresztezésekből és további 22, az 5. kiegészítő táblázatban felsorolt állatfajból származó DNS-izolátumokkal. A 2A-D ábra az assayChr9W, assayChr9D, assayChr1W és assayChr1D segítségével kapott amplifikációs görbéket mutatja. Az AssayChr9W enyhe keresztreaktivitást mutatott házisertéssel, szikaszarvassal, alpesi bakkal, juhval, kecskével és zergével (ΔCt ≥ 12,10, n = 2), az AssayChr9D pedig vaddisznóval, szikaszarvassal, jávorszarvassal, lóval és pulykával (ΔCt ≥ 8,41, n = 4). A 9. kromoszómán található rs81416363 SNP-t célzó tesztekkel ellentétben az assayChr1 nem mutatott keresztreaktivitást (kivéve az assayChr1W-t az őzek esetében a négy ismétlésből csak egy esetben). 50, általában élelmiszer-összetevőként használt növényfaj DNS-izolátumát is elemeztük (6. kiegészítő táblázat). Egyik teszt sem mutatott keresztreaktivitást egyik növényfajjal sem.

A különböző kereskedelmi master mixek alkalmazhatóságának szűrése

A következő kísérletsorozatban azt vizsgáltuk, hogy a kereskedelmi master mix típusa befolyásolja-e az assay-k szelektivitását. Összesen 23 állatfajból, köztük 3 vaddisznó egyedből és 11 házisertésfajtából/keresztezésből származó DNS-izolátumokat elemeztünk összesen öt különböző szállítótól származó mesterkeverékkel. A mesterkeverékeket és a hozzájuk tartozó hőmérsékleti programokat a 7. kiegészítő táblázat tartalmazza. Általánosságban elmondható, hogy a mesterkeverék típusa mind az abszolút Ct-értékeket, mind a ΔCt-értékeket befolyásolta a cél- és a keresztreagáló (al)fajok között. A valós idejű PCR-próbákat azonban eltérő mértékben befolyásolták. Az assayChr9W esetében például a 2. és 3. keverék magasabb Ct-értékeket eredményezett, mint az 1. (a jelen vizsgálatban használt standard master mix), 4. és 5. keverék (Ct ± SD (n = 6): 1. keverék: 25,03 ± 0,15; 2. keverék: 31,17 ± 1,70; 3. keverék: 28,43 ± 0,13; 4. keverék: 26,64 ± 0,10; 5. keverék: 26,64 ± 0,17). Az assayChr9D esetében a master mix típusa befolyásolta a ΔCt értékeket és ezáltal az assay szelektivitását. Az 1., 2., 3. és 4. mesterkeverékkel kapott ΔCt-értékek ≥ 8,41, ≥ 10,40, ≥ 7,18 és ≥ 5,86 voltak, míg az 5. mesterkeverékkel egyáltalán nem volt megfigyelhető keresztreaktivitás. Az assayChr1 esetében az 1., 3. és 4. mesterkeverékkel meglehetősen hasonló Ct-értékeket kaptunk. A 2-es és 5-ös mesterkeverékkel azonban nem keletkezett semmilyen termék, valószínűleg azért, mert ezek a keverékek nem alkalmasak multiplexelésre. Ezen eredmények alapján erősen javasoljuk az alkalmazhatóság vizsgálatát, ha más típusú mesterkeveréket kívánunk használni.

Robusztusság

A valós idejű PCR-próbák robusztusságát úgy vizsgáltuk, hogy a lágyítási hőmérsékletet ±1 °C-kal és a reakciómix lyukankénti térfogatát ±5%-kal változtattuk, valamint két különböző valós idejű PCR-ciklert alkalmaztunk. A kísérleteket vaddisznóból, házisertésből és őzből származó DNS-izolátumokkal végeztük. Az assayChr9W és az assayChr9D esetében a Ct-értékek nagyon hasonlóak voltak a standard körülmények között kapott értékekhez (ΔCt-értékek <1,00), kivéve, ha a lágyítási hőmérsékletet 61 °C-ra emeltük (ΔCt-értékek ≤2,16, illetve ≤1,57). A ≤0,77-es ΔCt-értékekkel az assayChr1 még robusztusabbnak bizonyult. Sem a teljes reakciótérfogat csökkentése, sem egy másik valós idejű PCR-cikláló használata nem befolyásolta lényegesen a Ct-értékeket, ami a valós idejű PCR-próbák robusztusságát bizonyítja.

Munkatartomány, lineáris tartomány és amplifikációs hatékonyság

Egy vaddisznó DNS-izolátum (211 µg/ml) és két házisertés DNS-izolátum (158 µg/ml és 160 µg/ml) vízben sorozatosan hígított (1:2-1:524,288), az assayChr9W, assayChr9D, assayChr1W és assayChr1D 211 µg/ml és 13 ng/ml között lineáris volt (R2 = 0.9948), 158 µg/ml és 10 ng/ml (R2 = 0,9981), 211 µg/ml és 6 ng/ml (R2 = 0,9994), illetve 160 µg/ml és 10 ng/ml (R2 = 0,9988) között (3A ábra). A standard görbék meredekségéből számított amplifikációs hatékonyság 83%, 96%, 93% és 95% volt. Ezenkívül a linearitási tartományt a vaddisznó és házisertés DNS-izolátumok sorozatosan hígított heringspermium DNS-ével történő elemzésével értékeltük. Az assayChr9W és az assayChr9D esetében a linearitás 20 µg/ml és 20 ng/ml (R2 = 0,9988), illetve 20 µg/ml és 39 ng/ml (R2 = 0,9985) között volt (3B. ábra). Az assayChr1W és az assayChr1D esetében a linearitás 20 µg/ml és 5 ng/ml (R2 = 0,9978), illetve 20 µg/ml és 10 ng/ml (R2 = 0,9988) között volt. A standardgörbék meredekségéből számított amplifikációs hatékonyság 76%, 90%, 97% és 101% volt.

Az eredmények azt mutatják, hogy a valós idejű PCR-mérések munkatartománya közel azonos, míg a linearitási tartomány szűkebb a 9-es kromoszómát célzó mérések esetében, mint az 1-es kromoszómát célzó mérések esetében. Az összes amplifikációs hatékonyság 90% és 110% között volt, az ENGL-irányelvek17 ajánlásának megfelelően, kivéve a Chr9W próbát (83% vízben, 76% heringspermium DNS-ben). Az assayChr9W alacsonyabb amplifikációs hatékonyságát valószínűleg a hibás illesztések miatt csökkent primer-kötési stabilitás okozza, amelyet a célállatfajra vonatkozó szelektivitás növelése érdekében vezettek be.

A kimutatási határ (LOD) heringspermium DNS-ben és sertés DNS-ben mint háttér-DNS-ben

A LOD-t úgy határozták meg, mint a legalacsonyabb DNS-koncentrációt, amely 20 ismétlésből legalább 19-ben a fluoreszcenciajel növekedését eredményezte. Ezenkívül a Ct-értéknek a keresztreagáló fajok esetében kapott Ct-érték alatt kellett lennie.

A heringspermium DNS-ében az assayChr9D (1,0%, w/w, ábra. 4A) valamivel magasabb volt, mint a másik három vizsgálat LOD értéke (0,2%, w/w, 4B-D ábra). Az assayChr9D magasabb LOD-ját a vaddisznóval való keresztreaktivitás okozta (a vaddisznó és a házisertés közötti ΔCt-érték csak ≥8,41).

Meghatároztuk továbbá a vaddisznóra, assayChr1W és assayChr9W valós idejű PCR-próbák LOD értékét házisertés DNS-sel, mint háttérrel, valamint a házisertésre, assayChr1D és assayChr9D próbák LOD értékét vaddisznó DNS-sel, mint háttérrel. 2%, 0,2%, 5% és 2% (w/w) esetén az assayChr9D (4E. ábra), assayChr9W (4F. ábra), assayChr1D (4G. ábra) és assayChr1W (4H. ábra) LOD-értékei meglehetősen eltérőek voltak. Az assayChr1D magasabb LOD-értékét a vaddisznó DNS jelenlétében a jel elnyomása okozta, valószínűleg a két szonda célszekvenciáért való versengése miatt a duplex vizsgálati formátumban. A jelszuppresszió részletesebb vizsgálatához a pozitív kontrollok (vaddisznó DNS és házisertés DNS) mellett olyan DNS-keverékeket is elemeztünk, amelyek 25% (m/m) vaddisznó DNS-t és házisertés DNS-t, illetve 25% (m/m) házisertés DNS-t és vaddisznó DNS-t tartalmaztak.

Amikor a pozitív kontrollokat összehasonlítottuk a nem cél-DNS-t tartalmazó, 1:4 arányban hígított standardokkal, nem találtunk különbséget az assayChr9W és az assayChr9D amplifikációs görbék (ΔRn értékek) között (5A,B ábra). Az assayChr1W és az assayChr1D esetében azonban a pozitív kontrollhoz kapott fluoreszcenciajelek (ΔRn-értékek) magasabbak voltak, mint az 1:4 arányban hígított standardhoz kapott jelek (5C,D ábra).

Megismételhetőség

A valós idejű PCR-vizsgálatok megismételhetőségét úgy vizsgáltuk, hogy 30% (m/m) cél-DNS-t és 70% (m/m) nem célzott alfaj DNS-t tartalmazó húskivonat-keverékeket, valamint ezek sorozathígításait négy különböző napon öt alkalommal duplikáltan elemeztük. A Ct-értékek RSD-értéke ≤1,0% (assayChr1W), ≤1,9% (assayChr9W), ≤2,3% (assayChr1D) és ≤3,5% (assayChr9D) volt, ami a vizsgálatok nagyfokú megismételhetőségét bizonyítja.

Vaddisznó és házisertés egyedekből származó minták elemzése

A valós idejű PCR-próbákat 64 házisertés egyedből származó minták elemzésére alkalmaztuk, beleértve 14 fajtát és 6 keresztezett fajtát (6A ábra). Ezenkívül összesen 30 vaddisznó mintát elemeztünk 5 különböző országból (Ausztria, Észtország, Németország, Románia és az USA, 6B. ábra). Egy Európából származó vaddisznó egyed esetében a pontos származás ismeretlen volt. Minden mintát legalább négy ismétlésben elemeztünk. Minden PCR-lemezhez egy pozitív kontrollt (DNS-keverék, 10 ng/µl) adtunk, amely a célzott alfajt a LOD koncentrációval megegyező koncentrációban tartalmazta, így megadva a cut-off Ct-értéket.

A pozitív kontrollokat 14 ismétlésben elemezve a Ct-értékek átlaga ± SD 33,85 ± 0,93 (assayChr9W), 35,19 ± 1,11 (assayChr9D), 32,89 ± 0,28 (assayChr1W) és 32,60 ± 0,47 (assayChr1D) volt. Az assayChr9D kivételével minden magasabb Ct-értéket eredményező mintát <LOD-nak tekintettünk. Az assayChr9D esetében több vaddisznóminta esetében ≥ 34,61 Ct-értéket kaptunk. A hamis pozitív eredmények valószínűségének csökkentése érdekében az assayChr9D Ct-értékének határértékét 34,00-ban határoztuk meg. Az assayChr9W és az assayChr9D rutinszerű analízisben történő alkalmazásához javasoljuk a 2% (m/m) házisertés DNS-ből, 0,2% (m/m) vaddisznó DNS-ből és 97,8% (m/m) hering spermium DNS-ből álló pozitív kontrollt használni.

A házisertés minták assayChr9D-vel történő elemzése során 63 pozitív és csak egy negatív eredményt kaptunk (Mangalica 1) (6. ábra). A 12 Cinta Senese egyedből két különböző húsrészt elemeztünk, egy sovány mintát (a longissimus dorsiból) és egy bőr alatti hátszalonna-mintát (a karajból) (az adatok nem láthatóak). A sovány mintákból kapott Ct-értékek (átlagos Ct ± SD 25,24 ± 0,44, n = 48) nagyon hasonlóak voltak a bőr alatti hátszalonna-mintákhoz (26,29 ± 0,35, n = 48). Amikor a 30 vaddisznómintát assayChr9D-vel elemeztük, 21 esetében nem emelkedett a fluoreszcenciajel, de kilenc egyedet (egy Ausztriából, öt Németországból és három az USA-ból) házisertésként azonosítottunk.

Az assayChr9W-vel a vaddisznóminták többségét helyesen rendeltük, csak három minta esetében (egy Németországból és két USA-ból) kaptunk negatív eredményt. Az assayChr9W azonban néhány házisertés egyed esetében is pozitív eredményre vezetett, köztük egy Bentheimi Fekete Pied, három Krškopolje és három Mangalica sertés esetében. Figyelemre méltó, hogy a három Ausztriából származó mangalica sertést házisertésként, míg a Németországból származó három egyedet vaddisznóként azonosítottuk. Az assayChr9 esetében, beleértve az assayChr9W és az assayChr9D vizsgálatot is, a 94 húsminta közül 12 nem egyértelmű eredményre vezetett, mivel mindkét valós idejű PCR-mintával a fluoreszcenciajel növekedését kaptuk. Továbbá egy mangalica sertés egyedet vaddisznóként, három vaddisznó egyedet pedig házisertésként azonosítottak.

Beugin és munkatársai vizsgálatában11 az SNP rs81416363 alkalmasságát a franciaországi Vogézek egyik természetes parkjában vadászott “tiszta” vaddisznókon és korlátozott számú kereskedelmi sertésfajtán (Landrace, Large White, Piétrain és Duroc) tesztelték. A vaddisznók a G allélt (gyakoriság 100%, nincs heterozigozitás), a házisertések az A allélt (gyakoriság 98%, heterozigozitás 5%) hordozták.

Az assayChr9W és az assayChr9D vizsgálat miért vezetett számos téves besoroláshoz és néhány nem egyértelmű eredményhez, a megfelelő vaddisznó- és házisertésmintákat nagy felbontású olvadáselemzéssel (HRM) genotipizáltuk. A HRM-analízist azért alkalmaztuk, mert ez egy nagy teljesítményű, idő- és költséghatékony technika az SNP-genotipizáláshoz18. A normalizált olvadási görbék (7A. ábra) azt mutatják, hogy a homozigóta G genotípust nemcsak a vaddisznó minták esetében találtuk meg, hanem a mangalica minta (1. minta) esetében is, amelynél a fluoreszcenciajel növekedését kaptuk az assayChr9W-vel, de az assayChr9D-vel nem. Az assayChr9D-vel a fluoreszcenciajel növekedését eredményező vaddisznómintákról kiderült, hogy az A allél legalább egy példányát hordozzák. Négy vaddisznó egyed mutatta a heterozigóta genotípust, öt pedig homozigóta volt az A allél tekintetében. Ezenkívül öt házisertés egyednél, köztük három szlovéniai krškopoljei egyednél az A és a G allélt is kimutatták. Így a HRM genotipizálással igazolni tudtuk, hogy az assayChr9W és assayChr9D módszerrel kapott eredmények összhangban vannak az egyedek genotípusával. Eredményeink azonban azt jelzik, hogy az SNP rs81416363-ra irányuló két singleplex assayChr9W és assayChr9D nem teszi lehetővé a vaddisznó és a házisertés egyértelmű megkülönböztetését.

Az assayChr1D segítségével három kivételével valamennyi házisertésmintát házisertésnek minősítették (6. ábra). Az assayChr9D-vel összhangban a 12 Cinta Senese egyedből származó sovány és bőr alatti hátszalonna mintákból kapott Ct-értékek nagyon hasonlóak voltak (átlagos Ct ± SD 25,99 ± 0,25 (n = 48), illetve 26,36 ± 0,25 (n = 48)). A Chr1D próbával azonban a 30 vaddisznóminta közül ötöt is házisertésként azonosítottak. A vaddisznóminták assayChr1W-vel történő elemzése csak egy negatív eredményt hozott. Az assayChr1W-vel azonban egy mangalica minta és hat turopoljei egyed is a fluoreszcenciajel növekedését eredményezte.

A Fontanesi és munkatársai10 vizsgálatában az SNP g.299084751. C > T genotipizálása öt kereskedelmi fajtából (olasz nagy fehér, olasz szárazföldi fajta, olasz duroc, belga szárazföldi fajta és piétrain) származó 293 házisertés és 201 dél-közép-európai (Észak-Olaszország) és délkelet-európai (Szlovénia és a nyugat-balkáni régió) vaddisznó mintáinak elemzésével történt. Fontanesi és munkatársai megállapították, hogy minden házisertés egyed homozigóta a T allélra. A vaddisznó egyedek 7,5%-a hordozta a T allél legalább egy példányát, a délkelet-európai egyedek gyakrabban (12,2%), mint a dél-közép-európai egyedek (3,6%). A délkelet-európai vaddisznók 11,1%-a heterozigóta C/T genotípusú volt.

Amikor HRM-elemzéssel genotipizáltuk a vaddisznó és házisertés egyedeket a g.299084751 C > T SNP-re, nemcsak a házisertésekben, hanem néhány vaddisznóban is kimutattuk a T allélt (7B ábra). Az USA-ból származó vaddisznó egyed homozigóta T genotípust mutatott, míg az Alsó-Ausztriából származó vaddisznó egyed a C és a T allélt is hordozta. A vaddisznó egyedek többsége azonban homozigóta volt a C allélra. Ez az eredmény azt jelzi, hogy a három vaddisznóminta (Németország Bad Kissingen és Perleberg, valamint Európa) esetében az assayChr1D-vel kapott fluoreszcenciajel növekedése nem állt összhangban a genotípusukkal, és ezért keresztreaktivitás okozta. A házisertés egyedek többsége homozigóta volt a T allélra. A nyolc Turopolje egyed közül hatnál azonban a heterozigóta C/T genotípust találták, ami megmagyarázza, hogy miért volt a fluoreszcenciajel növekedése mind az assayChr1D, mind az assayChr1W módszerrel. A heterozigóta C/T genotípus magas gyakorisága a Turopolje, egy horvátországi házisertésfajtában, összhangban van Fontanesi kutatócsoportjának egy nemrégiben megjelent tanulmányával. 47 Turopolje egyed genotipizálása során a T és a C allél gyakorisága 0,57, illetve 0,43 volt19.

Eredményeink azt mutatják, hogy sem az SNP rs81416363-ra irányuló két singleplex próba, sem a g.299084751 C > T SNP-re irányuló duplex próba önmagában nem teszi lehetővé a vaddisznó és a házisertés egyértelmű megkülönböztetését. A két singleplex assay és a duplex assay eredményeinek figyelembevételével azonban a megkülönböztető képesség drasztikusan növelhető. Eredményeink azt mutatják, hogy ha az azonos alfajra vonatkozó két teszt (pl. assayChr9D és assayChr1D) azonos osztályozáshoz vezet (az adott példában házisertés), és a másik alfajra vonatkozó két teszttel kapott eredmények (az adott példában assayChr9W és assayChr1W) nem egyértelműek, a téves osztályozás valószínűsége alacsony, ha az azonos eredményekre hagyatkozunk. Ezt a stratégiát követve 94 egyedből 86 (91,5%) egyedet lehetett helyesen besorolni.

Primer és szonda tervezése

A primer/szonda koncentráció és arány optimalizálása

Keresztreaktivitási vizsgálatok

A különböző kereskedelmi master mixek alkalmazhatóságának szűrése

Robusztusság

Munkatartomány, lineáris tartomány és amplifikációs hatékonyság

A kimutatási határ (LOD) heringspermium DNS-ben és sertés DNS-ben mint háttér-DNS-ben

Megismételhetőség

Vaddisznó és házisertés egyedekből származó minták elemzése

Similar Posts

Marc Jackson

1479: Balak 5773. Tamuz 14. 22/06/2013

Vélemény, hozzászólás? Kilépés a válaszból