PMC

A MAGzati hemoglobin szabályozásának molekuláris vizsgálatai révén javuló terápiák ígérete

Bár a fent tárgyalt nem célzott terápiás megközelítések ígéretesnek és némi sikernek bizonyultak a HbF kiváltásában klinikai körülmények között, a normális magzati-felnőtt hemoglobinváltáshoz szükséges molekuláris alapok jobb mechanisztikus megértése nagy ígéretet jelent arra, hogy a HbF indukciójára hatékonyabb és specifikusan célzott megközelítéseket lehessen kifejleszteni. A globingének molekuláris klónozását követő évtizedekben számos, a globingén szabályozásában szerepet játszó transzkripciós faktort azonosítottak (Cantor és Orkin 2002). Ezek közé tartoztak olyan transzkripciós faktorok, mint a GATA1, a KLF1 és az SCL/ TAL1. E faktorok globin génszabályozásban betöltött szerepének vizsgálatát azonban megzavarta e faktorok differenciálódásban betöltött széleskörű szerepe, valamint a globin és az eritroid génszabályozás szabályozójaként betöltött pleiotróp szerepük. Úgy tűnt, hogy e faktorok egyike sem specifikus szabályozója a magzati és a felnőtt hemoglobin közötti váltásnak. A globin gének kezdeti klónozásától számítva csaknem három évtizedbe telt, mire e folyamat specifikus szabályozóit azonosították.

A természetes emberi genetikai variáció tanulmányozása révén fontos támpontokat kaptunk e faktorok azonosításához. Számos csoport a HbF-szint közös genetikai variációjának alapjait kutatta mind célzott, mind genomszintű asszociációs vizsgálatok (GWAS) segítségével (Menzel és mtsai. 2007; Thein és mtsai. 2007; Lettre és mtsai. 2008; Uda és mtsai. 2008). E vizsgálatok eredményeképpen három olyan genomi lokuszt azonosítottak, amelyek a HbF-szintet befolyásoló közös variánsokat hordoznak. Ezek közé tartozott a 2. kromoszómának a BCL11A génen belüli régiója, a 6. kromoszómán a HBS1L és MYB gének közötti intergenikus régió, valamint a 11. kromoszómán lévő β-globin lókuszon belüli változatok. Az e genetikai variánsokat pontosabban feltérképező legújabb vizsgálatok azt sugallják, hogy a HbF-szintek eltérésének >50%-a e három lókusz közös variációjával magyarázható (Galarneau és mtsai. 2010). Bár a HbF-szinteknek feltehetően ∼80%-os örökletes genetikai összetevője van, fontos szem előtt tartani, hogy a közös genetikai variánsokból származó additív genetikai variáció figyelmen kívül hagyja a lehetséges magasabb rendű genetikai kölcsönhatásokat, amelyeket esetleg nem lehet kimutatni, ezért a jövőbeni vizsgálatokban még fel kell tárni, hogy a HbF-szintek milyen mértékben genetikailag meghatározottak (Zuk et al. 2012).

A BCL11A cink-ujjas transzkripciós faktoron belül a HbF-szintekkel összefüggő variánsok kezdeti megfigyelése egy olyan kezdeti vizsgálathoz vezetett, amely azt a hipotézist követte, hogy a BCL11A a HbF-expresszió szabályozója lehet (Sankaran és mtsai. 2008). Korábbi munkák azt sugallták, hogy a BCL11A kritikus transzkripciós szabályozó, amely részt vesz a B-limfopoézisben és a neurogenezisben (Sankaran és mtsai. 2010). Úgy tűnt, hogy a BCL11A fehérjeszintje korrelál az expresszió fejlődési stádiumával, így a primitív és magzati máj definitív erythroid sejtek, amelyek nagy mennyiségben kifejezték a γ-globint, a BCL11A teljes hosszúságú formáinak alacsony vagy hiányzó expressziójával rendelkeztek. Ez az eredmény arra utalt, hogy ez a géntermék a γ-globin gének represszoraként működik. Ennek közvetlen tesztelésére a BCL11A kiütését rövid hajszálú RNS (shRNS) megközelítésekkel végeztük primer felnőtt erythroid progenitorokban, és a γ-globin expressziója erőteljesen indukálható volt ilyen kiütés hatására. Úgy tűnt, hogy a γ-globin indukció mértéke összefügg a BCL11A knockdown mértékével. Érdekes módon az erythropoiesisben a tapasztalt erőteljes γ-globin-indukció ellenére nem mutatkoztak nagyobb zavarok. Későbbi vizsgálatok hasonló eredményeket mutattak a BCL11A expressziójának shRNS-ek segítségével történő leütése esetén (Borg és mtsai. 2010; Zhou és mtsai. 2010; Wilber és mtsai. 2011). Kimutatták továbbá, hogy a BCL11A közvetlenül kölcsönhatásba lép a kromatinnal a humán β-globin lokuszon primer eritroid sejtekben, és úgy tűnt, hogy a GATA1 transzkripciós faktorral és a NuRD kromatin remodelling és represszor komplexszel egy komplex részeként működik (Sankaran és mtsai. 2008). Érdekesség, hogy a NuRD komplex tartalmazza a HDAC 1-et és 2-et, amelyekről azt feltételezték, hogy a HbF csendesítéséhez szükséges kritikus HDAC-ok (Bradner és mtsai. 2010). Emellett felvetették, hogy a SOX6 transzkripciós faktor a BCL11A-val együttműködve segíthet a γ-globin gének elnémításában emberben, és nélkülözhetetlen lehet e globin gének proximális promóterének megkötéséhez (Xu et al. 2010).

Bár a hemoglobin átkapcsolása egérmodellekben, még azokban is, amelyek humán β-globin lókusz transzgént hordoznak, úgy tűnik, eltér az emberben megfigyelhető normál globin expresszió ontogenezisétől, egerekben kimutatták a BCL11A evolúciósan konzervált szerepét a globin gén csendesítésében és átkapcsolásában (Sankaran et al. 2009; McGrath et al. 2011). A BCL11A-t hiányoló egereknél normálisnak tűnik az eritropoézis, de nem képesek teljesen elnémítani az embrionális globin géneket a definitív eritroid sejtekben, és lehetővé teszik a γ-globin némi tartós expresszióját, amikor az intakt humán β-globin lókusz jelen van. Ezek az eredmények megerősítik a BCL11A mint a globinváltás kritikus közvetítőjének fontosságát az emlősökben. Bár ez a kezdeti tanulmány a BCL11A szerepével foglalkozott a globinváltás fejlődési folyamatában egerekben (Sankaran és mtsai. 2009), egy újabb tanulmány a BCL11A feltételes inaktiválásával kimutatta, hogy az indukálható inaktiválás robusztus és hasonló mértékű γ-globin génindukciót eredményezhet, mint amikor az inaktiválás korábbi időpontokban történik (Xu és mtsai. 2011). Továbbá, bár a globingének szabályozása eltérő az ember és az egér között, a BCL11A inaktiválása elegendőnek bizonyult ahhoz, hogy javítsa a sarlósejtes betegség egérmodelljeiben megfigyelhető hematológiai és patológiai jellemzőket, ami fontos elvi bizonyítékot szolgáltat a BCL11A célzott kezelésének potenciális hatékonyságára a HbF indukálása érdekében (Xu és mtsai. 2011).

A BCL11A pontos mechanizmusai, amelyek révén a BCL11A elnémítja a γ-globin gén expresszióját, továbbra sem világosak. Egy nemrégiben végzett tanulmány szerint ez mind a transzkripciós faktorokkal, például a SOX6-tal való kölcsönhatásokon keresztül közvetíthető, amelyek a proximális γ-globin promóterek kromatinjához kötődnek, mind pedig a β-globin génklaszter különböző régióival való hosszú távú kölcsönhatásokon keresztül (Xu és mtsai. 2010). Ha a BCL11A hiányzik, a β-globin lókusz konformációja úgy változik meg, hogy a lókusz kontroll régiójaként ismert upstream enhancer a transzkripcionálisan aktivált γ-globin génekkel párhuzamosan helyezkedik el. Hasonló jelenség fordul elő, amikor a sejteket olyan HDAC-inhibitorokkal kezelik, amelyek a γ-globin gén expresszióját indukálják (Bradner és mtsai. 2010). Nem világos azonban, hogy ezeket a konformációs változásokat közvetlenül a BCL11A közvetíti-e, vagy ezek a változások a BCL11A (vagy a HDAC) gátlás HbF-indukáló hatásának másodlagos következményei. Mindazonáltal ezek az eredmények erőteljesen alátámasztják azt az elképzelést, hogy a BCL11A a jelek szerint közvetlen szerepet játszik a γ-globin expressziójának csendesítésében a β-globin lókuszon belül. A humán β-globin lókuszon belüli különböző deléciók feltérképezésével, amelyek vagy δβ-thalasszémiát eredményeznek, a HbF szerény növekedésével és némi fennmaradó globinlánc-egyenlőtlenséggel, vagy HPFH-t, a HbF erőteljes növekedésével és kiegyensúlyozott globinlánc-szintézissel, kimutatták, hogy a δ-globin géntől felfelé egy N3 kb-os régió szükséges a γ-globin gének csendesítéséhez (2. ábra) (Sankaran et al. 2011c). Érdekes módon ez a régió a BCL11A kötőhelyeit rejti, olyan partnereivel együtt, mint a GATA1 és a HDAC1. Megjegyzendő, hogy ezt a régiót a Corfu thalassemia delécióval kapcsolatos emberi tanulmányok (Chakalova és mtsai. 2005) egymástól függetlenül is fontosnak találták a γ-globin csendesítésében (Chakalova és mtsai. 2005). Ez a tanulmány fontos mechanisztikus betekintést nyújt abba, hogy a BCL11A hogyan működik a HbF elnémításában, és megerősíti a természetes emberi mutációk fontosságát ennek az emberre jellemző fejlődési folyamatnak a megértésében (2. ábra) (Sankaran és mtsai. 2011c) (Sankaran és mtsai. 2011c).

Az eredmények ismeretében a BCL11A valószínűleg fontos terápiás célpont lehet. Az a tény, hogy inaktiválása anélkül indukálja a HbF-et, hogy az erythropoiesis jelentős zavarát eredményezné, nagyon ígéretes, bár ismert, hogy más vonalakban, például a B-limfocitákban is fontos hatásai vannak, ami hangsúlyozza az in vivo modellezés és elemzés fontosságát a BCL11A HbF-indukció célba vételére irányuló folyamatban lévő erőfeszítések részeként. A BCL11A működésének hatásmechanizmusait feltáró további vizsgálatok a HbF-indukció jobb és célzottabb megközelítéseihez vezethetnek (Sankaran és mtsai. 2011c). A SOX6 szintén potenciálisan ígéretes célpontja lehet a HbF indukciójának (Xu és mtsai. 2010), bár ismert, hogy szükséges a normális eritropoézishez (Dumitriu és mtsai. 2006). Ugyanakkor beszámoltak egy olyan betegről, akinél a SOX6 heterozigóta megszakadt, és nem volt emelkedett HbF-szint, ami arra utal, hogy a SOX6 génnek lehet egy dóziskompenzációs mechanizmusa, vagy hogy lehet egy bizonyos küszöbérték, amely e gén expressziójának csökkentéséhez szükséges ahhoz, hogy robusztus HbF-indukciót lehessen elérni (Sankaran és mtsai. 2011a). Ez arra utal, hogy a SOX6-ot potenciális HbF-indukciós célpontnak tekintve korlátok lehetnek.

A BCL11A-val kapcsolatos kezdeti tanulmányokat követően két tanulmány is azt sugallta, hogy a BCL11A expresszióját független és egymást kiegészítő megközelítéseket alkalmazva úgy tűnik, hogy a KLF1 eritroid-specifikus transzkripciós faktor szabályozza. Az egyik vizsgálatban a KLF1 hipomorf alléllel rendelkező egérben az embrionális globin expressziójának emelkedését eredményezte, és a humán β-globin lókusszal transzgenikus egerekben a γ-globin tartós expresszióját mutatták ki (Zhou és mtsai. 2010). Ennek eredményeképpen a kutatók megvizsgálták, hogy ugyanez a szabályozás történhet-e primer humán eritroid sejtekben, és shRNS megközelítésekkel hasonló összefüggést tudnak-e kimutatni. A kutatók ezután kimutatták, hogy ez a hatás a KLF1-nek a β-globin lókuszban kifejtett közvetlen hatásán keresztül, de a KLF1 knockdown esetén a BCL11A csökkent expresszióján keresztül közvetített közvetett hatásokon keresztül is jelentkezik. Ez az eredmény azt mutatta, hogy a KLF1 a BCL11A expresszió közvetlen pozitív transzkripciós szabályozója. Egy másik csoport a HPFH egy nem kapcsolt formájának genetikai alapjait vizsgálta, amelyről azt feltételezték, hogy ebben a családban a KLF1 miszense mutációjából ered (Borg és mtsai. 2010). A kutatók e betegek és nem érintett kontrollok primer sejtjeinek felhasználásával ki tudták mutatni, hogy a megfigyelt hatás részben a KLF1-nek a BCL11A-ra gyakorolt csendesítő hatásának tulajdonítható. A folyamatos bizonytalanság egyik területe a KLF1-mutációk különböző eseteiben megfigyelhető humán fenotípusokkal kapcsolatos. Bár az eredeti jelentésben a miszense mutáció minden recipiensénél emelkedett a HbF expressziója, meg kell jegyezni, hogy ez valójában a teljes hemoglobinszint 3% és 19% között változott. Ezenkívül az emberekben heterozigóta KLF1-mutációkról szóló más jelentések vagy az eritropoézis egyidejű zavarát mutatják, vagy pedig kevés hatást mutatnak a HbF-expresszióra (Arnaud és mtsai. 2010; Satta és mtsai. 2011). Újabb vizsgálatok azt sugallják, hogy a KLF1 ritka változatai valóban a HbF emelkedésével járnak, de úgy tűnik, hogy ez még hasonló mutációk esetén sem következetesen vagy azonos mértékben fordul elő (Gallienne és mtsai. 2012). Ennek a változatosságnak az alapjait még meg kell határozni, és fontos lesz jobban megérteni azokat a mechanizmusokat, amelyek révén a KLF1 közvetlenül és közvetve is befolyásolja a HbF expresszióját. Ez kritikus fontosságú lesz minden olyan jövőbeli munka szempontjából, amely a KLF1-et a HbF indukció céljára próbálja megcélozni, különösen, ha el akarjuk kerülni az ilyen gátlásnak az erythroid differenciálódásra gyakorolt nemkívánatos hatásait. Tekintettel azonban a KLF1 eritroid vonalon belüli specifitására, és ha a KLF1 globin génszabályozó aktivitása specifikusan megcélozható lenne, még mindig a HbF indukciójának egyik jelöltjének kell tekinteni.

A BCL11A-ban azonosított, az emberi HbF-szinttel összefüggő gyakori genetikai variánsokon kívül a GWAS-vizsgálatok kimutatták, hogy a HBS1L és MYB gének között a 6. kromoszómán intergenikusan elhelyezkedő variánsok vannak, amelyek a jelek szerint drámai hatással vannak az emberi HbF-szintre (Menzel et al. 2007; Thein et al. 2007; Lettre et al. 2008; Uda et al. 2008). Fontos annak a hatásmechanizmusnak a megértése, amellyel ezek a variánsok a HbF-szint változását eredményezik, mivel úgy tűnik, hogy az ezen a lókuszon található genetikai variánsok ugyanolyan nagy, vagy talán még nagyobb hatással vannak a β-hemoglobinopátiák klinikai morbiditására, mint a BCL11A lókuszon található variánsok (Galanello és mtsi. 2009; Nuinoon és mtsi. 2010). Érdekes módon ez a régió számos olyan szabályozó elemet tartalmaz, amelyekről feltételezték, hogy fontos szerepet játszanak a MYB expressziójának szabályozásában az erythroid progenitorokban (Mukai és mtsai. 2006; Wahlberg és mtsai. 2009; Stadhouders és mtsai. 2011). Bár úgy tűnt, hogy a HBS1L overexpressziója nem befolyásolja a γ-globin expresszióját a K562 eritroleukémiás sejtekben, úgy tűnt, hogy a MYB overexpressziója befolyásolja az e sejtekben termelt γ-globin szintjét (Jiang és mtsai. 2006). Sőt, az emberből származó primer eritroid progenitorok kultúráiban, amelyekben a HbF nagyobb mértékben expresszálódott, gyakrabban csökkent a MYB expressziója (Jiang és mtsai. 2006).

A 13-as kromoszóma triszómiájával rendelkező betegeknél a 13-as kromoszóma triszómiája miatt késleltetett magzati-felnőtt hemoglobinváltás következik be, és a HbF továbbra is tartósan expressziós (Huehns és mtsai. 1964; Sankaran és Sapp 2012), a legújabb vizsgálatok további bizonyítékkal szolgáltak a MYB HbF-expresszió szabályozásában betöltött szerepére. A 13-as kromoszóma egy olyan régiójának génjeinek finomtérképezésével és integratív genomikai elemzésével, amely a 13-as kromoszóma részleges triszómiájában szenvedő betegeknél megfigyelhető HbF-emelkedéshez szükséges, két olyan kis ∼22 nukleotid RNS-molekulát, a 15a és 16-1 mikroRNS-t találtak, amelyek a legjobb jelöltek az ilyen tevékenység végzésére (Sankaran és mtsai. 2011b). Ezeknek a mikroRNS-eknek az overexpressziója primer felnőtt eritroid sejtekben tenyészetben a γ-globin termelésének növekedését eredményezte. E mikroRNS-ek célpontjait vizsgálva megállapították, hogy az egyik fő célpont az eritroid sejtekben a MYB. A MYB közvetlen kiütése primer felnőtt erythroid progenitorokban a γ-globin termelés drámai növekedését eredményezte (Sankaran és mtsai. 2011b), összekapcsolva ezt a ritka humán aneuploidia szindrómából származó történelmi megfigyelést a HbF szintjét szabályozó molekuláris mechanizmusokat vizsgáló újabb munkákkal.

A mechanizmus, amellyel a MYB a HbF szintjét szabályozhatja, továbbra sem világos. Ez lehet az eritropoézis kinetikájára gyakorolt hatásnak köszönhető, vagy alternatívaként a β-globin lókuszon belüli közvetlen hatás eredményeként is bekövetkezhet (Higgs és Wood 2008). További munkára lesz szükség az ilyen mechanizmusok feltárásához, és nagy ígéretet jelentenek az e molekula HbF-indukcióra irányuló terápiás célzott kísérletekhez. Aggodalomra ad okot, hogy a MYB célzott kezelése nemkívánatos mellékhatásokkal járhat, különösen a MYB vérképzésben betöltött pleiotróp szerepe miatt (Emambokus és mtsai. 2003; Carpinelli és mtsai. 2004). A legújabb munkák azonban azt sugallják, hogy az ilyen stratégiák valóban ígéretesek lehetnek, mivel a Myb részleges kiütése egerekben kevés hatással volt a normális in vivo vérképzésre, miközben drámai módon gátolta a leukémiák progresszióját (Zuber és mtsai. 2011a). Ezért a MYB részleges gátlása a HbF indukció értékes stratégiájaként ígéretes lehet. A HBS1L-MYB intergenikus régió variánsainak és a BCL11A lokusz variánsainak additív hatása (Lettre és mtsai. 2008; Galanello és mtsai. 2009; Nuinoon és mtsai. 2010) arra utal, hogy e két útvonal együttes megcélzása még erőteljesebb hatásokat eredményezhet, mint bármelyik útvonal önmagában történő megcélzása.

Noha a HbF szabályozásának fent tárgyalt szabályozóit humán genetikai vizsgálatok során találták meg, megerősítve ezzel in vivo jelentőségüket az emberben, számos más molekuláról is feltételezték, hogy szerepet játszanak a γ-globin gén szabályozásában különböző sejtkultúrás megközelítésekkel vagy egérmodellekkel végzett vizsgálatok során (1. táblázat). Ezeket a molekulákat az alábbiakban tárgyaljuk. Fontos szem előtt tartani, hogy a γ-globin génszabályozás tanulmányozására jelenleg rendelkezésre álló kísérleti rendszerek többségének vannak korlátai. Úgy tűnik, hogy a primer humán eritroid sejtek megengedőek az olyan manipulációkkal szemben, amelyek lehetővé teszik a γ-globin termelésének növekedését, ami nem biztos, hogy mindig releváns az emberekben in vivo. Ezen túlmenően számos olyan inger, amelyről ismert, hogy in vivo emberekben γ-globin termelést indukál, beleértve a különböző típusú stressz erythropoiesist és a hydroxyurea kezelést, nem működik úgy, hogy a γ-globin termelést indukálja humanizált egérmodellekben (Pace et al. 1994; Sankaran et al. 2009), hangsúlyozva egy fontos korlátot az ebben a kísérleti rendszerben kapott negatív eredmények értelmezésében. Ezért óvatosan kell eljárni, amikor olyan kísérleti eredményeket értelmezünk, amelyeket nem támasztanak alá humán genetikai vizsgálatokból vagy emberen vagy főemlősökön in vivo végzett vizsgálatokból származó bizonyítékok.

A γ-globin gének promóterében található direkt ismétlődő elemeket kötő fehérjéket vizsgálva, a TR2 és TR4 árva nukleáris hormonreceptorok a γ-globin gének expressziójának represszoraként játszanak szerepet (Tanabe et al. 2002, 2007; Cui et al. 2011). Paradox módon a TR2 és a TR4 túlterjedése transzgenikus egérmodellekben a γ-globin emelkedett expresszióját eredményezi, és sarlósejtes betegség egérmodelljeiben túlterjedve ezen egerek hematológiai és patológiai tüneteinek részleges javulását eredményezheti (Campbell és mtsai. 2011). A TR2 és TR4 esetében még meg kell állapítani az e megfigyelések hátterében álló mechanizmusokat és a humán globin génszabályozásra való vonatkozást. Ezenkívül a COUP-TFII árva nukleáris hormon nukleáris receptorról is feltételezték, hogy kötődik a közvetlen ismétlődésekhez és elnyomja a γ-globin promóterét emberben (Filipe és mtsai. 1999). Primer felnőtt erythroid sejtek in vitro tenyészeteinek felhasználásával kimutatták, hogy az olyan citokinek, mint az SCF, úgy tűnik, hogy lefelé szabályozzák a COUP-TFII expresszióját és kromatinfoglaltságát a β-globin lokuszon, ami a γ-globin fokozott expresszióját eredményezi (Aerbajinai és mtsai. 2009). Ezenkívül a COUP-TFII kis interferáló RNS-ek (siRNS-ek) segítségével történő közvetlen down-regulációja a γ-globin termelésének növekedését eredményezheti (Aerbajinai és mtsai. 2009). A COUP-TF-nek a HbF szabályozásában betöltött szerepével kapcsolatos további vizsgálatokra lesz szükség ahhoz, hogy jobban megértsük fiziológiai szerepét az emberben.

A közelmúltban végzett vizsgálatok a PRMT1 barátjának (FOP1) nevezett gén szerepét is felvetették a γ-globin génexpressziójának elnyomásában (van Dijk és mtsai. 2010). A FOP1 knockdownja emelkedett HbF-expressziót eredményez humán adult eritroid sejtekben kultúrában. Azt feltételezték, hogy ezt a SOX6 csökkent expressziója közvetíti, amelynek knockdownja közismerten szintén a γ-globin termelésének növekedését eredményezi (Xu és mtsai. 2010). További munkára lesz szükség ezen eredmények megerősítéséhez, annak megértéséhez, hogy ez a gén tágabb értelemben is szerepet játszik-e az eritropoézisben, valamint a megfigyelések hátterében álló mechanizmus vizsgálatához.

Az NF-E4 stádium-szelektáló fehérje NF-E4 szerepét is feltételezték egyes vizsgálatok, mint a γ-globin expresszió aktivátorát emberben (Jane és mtsai. 1995; Zhao és mtsai. 2006). Felvetették, hogy az NF-E4 rövid formája szerepet játszhat a γ-globin gének elfojtásában azáltal, hogy gátolja az NF-E4 normál aktiváló funkcióját e gének promóterénél (Zhou és mtsai. 2004). Ezek a vizsgálatok mind tenyésztett sejteken végzett kísérleteken és a K562 sejtekből származó fehérjekomplexek biokémiai tisztításán alapultak, ezért további munkára lesz szükség ahhoz, hogy megerősítsük e gén fiziológiai szerepét a γ-globin expressziójában, és jobban megértsük azokat a mechanizmusokat, amelyeken keresztül ez a komplex a humán globin génszabályozás megváltoztatására hathat.