Pathogenesis In Vitro
Le cellule epiteliali colonnari sono cellule morte che sperimentano due estremi di pH contemporaneamente. Apicalmente, sono immerse nei fluidi intestinali altamente alcalini e basalmente sono immerse nell’emolinfa leggermente acida. Queste condizioni sono difficili da imitare nella coltura cellulare, un fatto che può spiegare la scarsità di informazioni disponibili sull’infezione primaria.
Le linee cellulari che supportano la replicazione di GV sono rare e attualmente esistono solo per CpGV. Di conseguenza, sappiamo poco di più sui meccanismi dell’infezione da GV di quanto sappiamo sull’infezione da ODV. Anche così, sappiamo che durante la morfogenesi del nucleocapside di GV, la membrana nucleare della cellula ospite si disintegra, un evento che non interrompe l’elaborazione del nucleocapside. La scomparsa della membrana nucleare è caratteristica e non si verifica nelle cellule ospiti infettate da NPV.
Sono state stabilite diverse linee cellulari di insetti che supportano le infezioni da NPV. La maggior parte delle linee cellulari sono derivate da ovaie o embrioni di bruco. AcMNPV può replicarsi in linee cellulari derivate da diverse specie di insetti, un fatto che contribuisce a renderlo il baculovirus meglio studiato. In una curva di crescita standard a una fase, AcMNPV BVs tipicamente sono prodotti 12-20 h post infezione (hpi), e occlusioni, 20-48 hpi. La replicazione della maggior parte degli altri NPV nella coltura cellulare richiede ore o giorni in più.
AcMNPV BV è 1000 volte più infettivo di ODV, principalmente a causa della presenza della sua proteina di fusione, GP64. I BV entrano nelle loro cellule bersaglio tramite endocitosi mediata dalla clatrina. I nucleocapside BV penetrano in profondità nel citoplasma delle cellule bersaglio essendo rilasciati dagli endosomi. Usando questa strategia, i nucleocapidi aggirano l’ambiente potenzialmente pericoloso che si trova appena sotto la membrana plasmatica ed entrano nella cellula più vicino al nucleo di quanto la fusione sulla membrana plasmatica permetterebbe. Gli spostamenti conformazionali sensibili al pH sperimentati dalle proteine di fusione BV servono a innescare un evento di fusione tra l’involucro virale e la membrana endosomiale.
La fuga del nucleocapside di AcMNPV dall’endosoma è immediatamente seguita dalla sua associazione con cavi di F-actina. La formazione dei cavi è transitoria e si verifica durante il periodo in cui i nucleocapside virali si spostano verso il nucleo e vi entrano. Durante il transito, i nucleocapside virali si co-localizzano con un’estremità di un cavo di actina, possibilmente attraverso P78/83, una proteina legante la F-actina che si pensa sia situata alla base dei nucleocapside. L’associazione dei nucleocapside con i cavi di F-actina e il ritardo dell’espressione del gene reporter in presenza di farmaci che interrompono la funzione di actina/miosina suggeriscono che i cavi possono facilitare il trasporto dei nucleocapside al nucleo, o mediare il loro passaggio attraverso i pori nucleari.
NPV e alcuni nucleocapside GV entrano nei nuclei attraverso i pori nucleari. Alcuni GV si spellano ai pori nucleari, ma la maggior parte dei baculovirus si spellano all’interno del nucleo. La trascrizione dei primi geni inizia immediatamente, mediata dalla RNA polimerasi II dell’ospite (Pol II). Tra i primi geni espressi c’è un sottoinsieme la cui espressione porta a un efficiente trasporto e accumulo di G-actina all’interno del nucleo (Figura 5). Questa spettacolare manipolazione della localizzazione dell’actina è critica per la produzione di progenie di NPV e non è stata descritta per nessun altro patogeno. I geni coinvolti nella localizzazione nucleare dell’actina, identificati negli esperimenti di trasfezione transitoria, includono ie1, pe38, Ac004, Ac152, he65 e Ac102. Due dei geni, ie1 e Ac102, sono conservati tra tutti i lepidotteri NPV e GV, ed entrambi sono essenziali.
Figura 5. G-actina nucleare in cellule infettate da AcMNPV. (a) 4′,6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI) – cellule infettate colorate; (b) cellula infettata che esprime la proteina fluorescente verde trasfettata (GFP)-actina. (c) La mancanza di colorazione nucleare con rodamina falloidina indica che l’actina nucleare è monomerica.
Il passaggio alla fase finale dell’infezione è l’inizio del periodo di produzione della progenie BV; le attività cellulari sono orientate a sintetizzare i componenti virali alla massima velocità, assemblandoli in prodotti nucleocapside e poi esportandoli. La sintesi macromolecolare dell’ospite viene interrotta durante questo periodo, ma la struttura della cromatina dell’ospite rimane intatta fino alla morte cellulare. I geni virali tardivi e molto tardivi sono espressi da una RNA polimerasi codificata dal virus.
I microtubuli, riorganizzati durante la fase iniziale dell’infezione, sono depolimerizzati da fattori prodotti durante la fase tardiva che portano all’arrotondamento delle cellule (Figura 6). Allo stesso modo, la G-actina, accumulata all’interno del nucleo durante la fase iniziale, si polimerizza durante la fase finale, in concomitanza con il rigonfiamento nucleare e la scomparsa delle strutture nucleari visibili dell’ospite (Figura 7). Lo stroma virogenico, il sito della sintesi del DNA virale, si forma al centro del nucleo ed è intervallato e circondato da una zona elettron-lucente chiamata “zona ad anello”, un luogo in cui i capside sono assemblati e legati durante il caricamento del genoma. La F-actina nucleare si co-localizza con la principale proteina del capside di AcMNPV nella zona ad anello (Figura 7).
Figura 6. AcMNPV-infettati cellule Sf21 dimostrando diverse fasi di effetto citopatico (CPE). (a) cellule non infettate. Si noti la forma del fuso e la presenza di strutture di nucleocromatina. (b) cellule infettate da AcMNPV che mostrano CPE precoce e tardivo. Le cellule sono arrotondate a causa della depolimerizzazione dei microtubuli, i nuclei sono più grandi e liberati dalle strutture dell’ospite, e lo stroma virogenico (vs) è circondato dalla zona anulare (rz). Gli stromi virogenici diventano più densi con il progredire della fase finale dell’infezione. I poliedri riempiono il nucleo durante la fase molto avanzata dell’infezione (p).
Figura 7. F-actina nucleare in cellule infettate da AcMNPV durante l’espressione genica tardiva. (a) La colorazione DAPI indica la posizione del nucleo. (b) La fluorescenza verde indica che la proteina del capside è localizzata principalmente nella zona ad anello del nucleo. (c) La colorazione con rodamina falloidina mostra che la F-actina si co-localizza con il capside nella zona anulare.
La F-actina nucleare è necessaria per la produzione di BV. In presenza di farmaci che alterano la F-actina, i capidi virali sono malformati e appaiono come lunghe strutture tubolari giustapposte alla membrana nucleare interna con macchie poco frequenti di materiale denso di elettroni. Le piastre di base e le strutture del cappuccio normalmente presenti non sono evidenti, e viene prodotto un eccesso di profili membranosi. La sintesi del DNA virale avviene al tasso normale, ma i genomi non sono impacchettati, e lo stroma virogenico ha un aspetto “rilassato” rispetto allo stroma normale. È interessante notare che il fenotipo per l’assenza di AcMNPV very late factor-1 (VLF-1) è simile, suggerendo che VLF-1 può essere coinvolto nel legare i capidi allo stroma virogenico, e che la F-actina è un componente dello stroma a cui i capidi sono attaccati, direttamente o indirettamente.
P78/83, una proteina minore del capside espressa tardivamente durante l’infezione, è essenziale per la vitalità di AcMNPV. Questa caratteristica è stata notata più di 30 anni fa e sfruttata nei primi kit commerciali di espressione dei baculovirus. P78/83 (78 kDa quando non è fosforilata e 83 kDa quando è fosforilata) si pensa che faccia parte delle piastre di base di entrambi i capside BV e ODV. P78/83 è una proteina che si lega alla F-actina, e questa attività può aiutare a legare i capidi alla matrice nucleare durante l’assemblaggio. È interessante notare che P78/83 contiene un’altra attività che spiega perché è essenziale: promuove la polimerizzazione dell’actina all’interno del nucleo. P78/83 contiene domini conservati nei membri della famiglia delle proteine della sindrome di Wiskott-Aldrich (WASP), fattori che promuovono la nucleazione dei filamenti di actina. I membri della famiglia WASP regolano positivamente l’attività di nucleazione dell’actina del complesso Actin Related Protein (Arp)-2/3. Il complesso a sette subunità, conservato in tutti gli eucarioti, viene traslocato nel nucleo nelle cellule infettate da AcMNPV e viene attivato da P78/83. Le mutazioni in P78/83 che portano a una minore capacità di promuovere la nucleazione dell’actina portano corrispondentemente a una minore capacità di produrre BV infettivo.
Subito dopo l’ingresso nel nucleo, il DNA di AcMNPV adotta una struttura simile a quella dei nucleosomi e utilizza i nucleosomi e i processi legati ai nucleosomi nella replicazione del genoma. Una componente della strategia di replicazione virale, quindi, sembra essere il dirottamento dei componenti, se non dell’intera capacità di rimodellamento della cromatina dell’ospite. Prove recenti suggeriscono che la famiglia di proteine BRO (baculovirus ripetuto orf) sono probabili partecipanti a questo processo. Le proteine BRO sono espresse precocemente durante l’infezione, legano il DNA a singolo filamento (ssDNA) e gli istoni del nucleo, e si dividono con gli istoni negli esperimenti di frazionamento. BmNPV, orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus, e lymantria dispar multiple nucleopolyhedrovirus hanno tutti più geni bro. AcMNPV porta solo un gene bro, correlato a BmNPV bro-d, che è essenziale.
AcMNPV-encoded P6.9, la proteina di imballaggio del genoma altamente basilare, inizia ad accumularsi durante la fase finale dell’infezione ed emerge una struttura cromatinica alternativa.
Le interazioni P6.9-DNA sono controllate dallo stato di fosforilazione di P6.9. Durante il confezionamento del genoma, il DNA genomico dallo stroma virogenico si lega con P6.9 mentre P6.9 è defosforilato, condensandosi in una guaina del capside preformato attraverso un’apertura in una struttura terminale conica. Le strutture coniche si trovano prossimalmente allo stroma virogenico con guaine del capside coperte da piastre di base che si estendono distalmente in uno spazio meno denso di elettroni, la zona ad anello. La F-actina e la proteina del capside si co-localizzano nella zona ad anello, insieme a P78/83 e al complesso Arp2/3. È questa fase della replicazione che è influenzata sia dai farmaci che interrompono la F-actina sia dall’assenza di VLF-1.
Con l’inizio della fase molto tardiva dell’infezione c’è una riduzione della produzione di BV e c’è un inizio della produzione di ODV. I nucleocapside appena assemblati rimangono all’interno del nucleo dove sono avvolti in involucri che si pensa siano derivati dalla membrana nucleare interna. I virioni avvolti, ma non i nucleocapside non sviluppati, si occludono in una matrice proteica per formare capsule o poliedri. Le cellule alla fine muoiono, rilasciando le occlusioni nel mezzo.