La colocalizzazione ad alta risoluzione di una singola molecola di Cy3 e Cy5 attaccata alle macromolecole misura le distanze intramolecolari nel tempo

Materiali e metodi

Preparazione del DNA duplex. Per fare le molecole di DNA duplex 30-bp, due oligonucleotidi con la seguente sequenza e modifiche sono stati ibridati (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). L’oligonucleotide 5′-GGGTATGGAGATTTAGCGGAGTGACAGC-3′ è stato marcato con Cy5 alla sua estremità 5′ e con Cy3 alla sua estremità 3′. L’oligonucleotide complementare è stato marcato con biotina ad entrambe le estremità.

Espressione e purificazione della proteina. Il gene della proteina fluorescente gialla (YFP) nel plasmide p2Bac/pFastBac-YFP-M5-CaM (un regalo di H. Lee Sweeney, University of Pennsylvania, Philadelphia) è stato eliminato mediante PCR. Il risultante p2Bac/pFastBac-M5-CaM plasmide codifica per la miosina V del pollo che è troncata a Glu-1099. Uno zip di leucina ha seguito la spirale nativa per garantire la dimerizzazione. Per facilitare la purificazione, la proteina miosina V è stata etichettata N-terminalmente con un FLAG-tag (DYKDDDDK). Due baculovirus ricombinanti sono stati generati per l’espressione della proteina in cellule Sf9. Uno codificava la miosina V troncata e la calmodulina di Drosophila melanogaster derivata dal plasmide p2Bac/pFastBac-M5-CaM. Il secondo virus codificava la catena leggera essenziale umana derivata dal plasmide p2Bac/pFastBac-ELC. Entrambi i virus sono stati usati per la coinfezione di cellule Sf9. La proteina è stata espressa e purificata come descritto da Sweeney et al. (20).

Etichettatura e scambio di calmodulina. La calmodulina è stata espressa e marcata con Cy3 o Cy5 come segue: Una singola cisteina è stata introdotta nella calmodulina del riccio di mare per mezzo della mutazione Q143C. Questa calmodulina è stata espressa in Escherichia coli e purificata come descritto in rif. 21. La calmodulina è stato etichettato con Cy3-maleimide o Cy5-maleimide (Amersham Biosciences) soluzioni stock (in DMSO) ad un 1,4 volte rapporto molare per 20 min. Il colorante in eccesso è stato rimosso mediante filtrazione su gel in tampone di scambio (sotto), seguita da un assorbimento idrofobico notte su BioBeads (Bio-Rad). Incorporazione etichetta era 102% per Cy3-calmodulina e 75% per Cy5-calmodulina. Le aliquote sono state conservate a -80°C.

Lo scambio di calmodulina etichettata sulla miosina V è stato eseguito come descritto ma con alcune modifiche (22). La miosina V (150 nM) è stata incubata con 0,7 nM di calmodulina marcata con Cy3 e 0,8 nM di calmodulina marcata con Cy5 in tampone di scambio (25 mM KCl/20 mM imidazolo HCl, pH 7,4/2 mM MgCl2/1 mM EGTA) a 22°C per 2 minuti. Per scambiare le calmoduline, è stato aggiunto 0,9 mM CaCl2 e la miscela è stata incubata a 22°C per 5 min. La reazione è stata spenta con 7 mM EGTA. La miscela di reazione è stata applicata su un dispositivo di ultrafiltrazione Nanocep 100K MWCO (Pall) e lavato tre volte con volumi uguali di AB (sotto) per purificare la miosina V da calmodulina in eccesso.

Preparazione cella di flusso. La cella di flusso è stato costruito con un vetrino da microscopio e coprioggetti altamente rifrangenti in NLAF21 (VA Optical Labs, San Anselmo, CA) tenuti insieme da pezzi di nastro adesivo biadesivo.

Per gli esperimenti di miosina V, 15 microlitri di biotina-BSA (1 mg-ml-1) è stato incubato nella cella di flusso per 2 min, dopo di che 30 microlitri di tampone AB (25 mM KCl/25 mM imidazolo HCl, pH 7,4/1 mM EGTA/4 mM MgCl2/10 mM DTT/1 mg-ml-1 BSA) è stato passato attraverso la cella di flusso per lavarlo. Quindici microlitri di 0,5 mg / ml NeutrAvidin (Molecular Probes) è stato aggiunto alla cella ed è stato permesso di incubare per 2 min, dopo di che un altro lavaggio è stato fatto con tampone AB. La cella di flusso è stato incubato con 15 microlitri di biotinilato filamenti di actina falloidina (250 nM) per 5 min, seguita da un lavaggio 100-μl con tampone AB. Infine, la cella è stata caricata con 20 microlitri di buffer di imaging tra calmodulina scambiato miosina V, 5 microlitri di calmodulina, 300 nM ATP, un sistema di rigenerazione ATP (0,1 mg-ml-1 creatina fosfochinasi/1 mM creatina fosfato), e 0,5% (vol / vol) Triton-X 100 per ridurre il legame aspecifico. La cella è stata sigillata con grasso sottovuoto e imaged immediatamente. La concentrazione finale del motore ha portato in actina scarsamente decorato e quindi ha permesso un’analisi di singole molecole di miosina V.

Per gli esperimenti di DNA, la biotina-BSA e NeutrAvidin sono stati caricati nello stesso modo come per gli esperimenti di miosina V, ma i lavaggi sono stati fatti con tampone T50 (10 mM Tris, pH 8,0/50 mM NaCl). Una volta che la cella di flusso aveva un rivestimento NeutrAvidin, 15 microlitri di dsDNA (30 nM) in tampone T50 con 1 mg-ml-1 BSA sono stati fatti scorrere in e incubato per 2 min, dopo di che 100 microlitri di buffer di imaging è stato fatto scorrere in. La cella di flusso è stato poi sigillato con grasso vuoto e prontamente imaged. La decorazione risultante di molecole di DNA sulla superficie era sufficientemente scarsa che i punti fluorescenti da diverse molecole raramente si sovrapponevano.

Microscopio Setup. Il microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) è stato impostato come descritto in rif. 8, con alcune modifiche (Fig. 5, che è pubblicato come informazioni di supporto sul sito web PNAS). Fasci sorgente di eccitazione a 532 nm (Coherent, Santa Clara, CA) e 633 nm (JDS Uniphase, San Jose, CA) sono stati combinati da uno specchio dicroico e ampliato ad un diametro di 7 mm. Queste fonti sono state messe a fuoco (lunghezza focale = 500 mm) sul piano focale posteriore di un obiettivo Olympus 1,65 NA ×100 TIRF per mezzo di una linea laser dicroico su una traduzione lineare DeepL che permette il funzionamento del microscopio sia in epifluorescenza o modalità TIRF. L’obiettivo è stato posizionato sotto un chiuso-loop, due assi, piezo traduzione nanoDeepL dotato di sensori capacitivi per la misurazione della posizione (Physik Instrumente, Auburn, MA). La luce riflessa che esce dall’apertura posteriore dell’obiettivo è stata diretta su un fotodiodo quadrante per fornire un segnale per un ciclo di feedback di messa a fuoco che ha bloccato la distanza tra l’obiettivo e il campione con un attuatore elettrostrittivo (Newport, Fountain Valley, CA). L’emissione di fluorescenza è stata raccolta dall’obiettivo, passata attraverso due filtri StopLine film sottile notch (Semrock, Rochester, NY), uno per ogni fonte di eccitazione, e trasmessa attraverso un apparato a doppia vista che ha permesso l’imaging simultaneo dei canali Cy3 e Cy5 su una singola fotocamera iXon DV 887 EMCCD (Andor Technology, Belfast, Irlanda). Tutti i dati sono stati ripresi con un 0.5-sec tempo di integrazione. Crosstalk tra i due canali (10%) presumibilmente distorce le misure di distanza verso valori più piccoli. Il nostro errore sperimentale, tuttavia, lo rende impercettibile, come dimostrato da simulazioni Monte Carlo in cui 100 coppie di immagini modellate di singoli fluorofori separati da 10 nm sono stati creati e analizzati identicamente come con i dati del DNA (descritto di seguito). Le immagini simulate delle funzioni di diffusione del punto di fluorescenza sono state calcolate generando una distribuzione di intensità gaussiana 2D integrata con uno sfondo costante a cui è stato aggiunto il rumore del colpo. I picchi simulati avevano le stesse dimensioni e lo stesso rapporto segnale-rumore dei picchi reali. I dati simulati con 10% crosstalk e dati simulati senza crosstalk sono indistinguibili da un test di Kolmogorov-Smirnov (N 1 = 100, N 2 = 100, p > 0,05).

Analisi dei dati. Una mappatura di registrazione dei canali Cy3 e Cy5 è stata eseguita con fiducials costituito da 100-nm TransFluoSphere perline (Molecular Probes). Sono stati eccitati a 532 nm, ed emettono con un ampio spettro di emissione. La perlina era rilevabile in entrambi i nostri canali. Abbiamo individuato una singola perlina associata al coprioggetto, e con il nostro stadio piezo abbiamo fatto un passo con precisione nanometrica in un modello di griglia (con una spaziatura 0.5-μm), prendendo un’immagine ad ogni fermata. Il risultato finale è stato una pila di 312 immagini che mostra la perlina in entrambi i canali in posizioni diverse (Fig. 1a ).