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LA PROMESSA DI MIGLIORARE LE TERAPIE ATTRAVERSO GLI STUDI MOLECOLARI DELLA REGOLAZIONE DELL’EMOGLOBINA FETALE

Anche se gli approcci terapeutici non mirati discussi sopra hanno mostrato promesse e qualche successo nell’indurre la HbF in ambienti clinici, una migliore comprensione meccanicistica dei fondamenti molecolari necessari per il normale passaggio dell’emoglobina dal feto all’adulto è molto promettente per consentire lo sviluppo di approcci più efficaci e specificamente mirati per l’induzione dell’HbF. Nei decenni successivi alla clonazione molecolare dei geni della globina, è stata identificata una varietà di fattori di trascrizione che svolgono un ruolo nella regolazione del gene della globina (Cantor e Orkin 2002). Questo includeva fattori di trascrizione come GATA1, KLF1, e SCL/ TAL1. Tuttavia, lo studio del ruolo di questi fattori nella regolazione dei geni globinici è stato confuso dall’ampio ruolo di questi fattori nella differenziazione e dai loro ruoli pleiotropici come regolatori della regolazione dei geni globinici ed eritroidi. Nessuno di questi fattori sembrava essere regolatori specifici dell’interruttore dell’emoglobina da feto ad adulto. Ci sono voluti quasi tre decenni dalla clonazione iniziale dei geni della globina prima che i regolatori specifici di questo processo fossero identificati.

Importanti indizi sull’identità di tali fattori sono venuti dallo studio della variazione genetica umana naturale. Un certo numero di gruppi ha cercato la base per la variazione genetica comune nei livelli di HbF usando sia studi di associazione mirati che genome-wide (GWAS) (Menzel et al. 2007; Thein et al. 2007; Lettre et al. 2008; Uda et al. 2008). Questi studi hanno portato all’identificazione di tre loci genomici che ospitano varianti comuni che influenzano i livelli di HbF. Ciò includeva una regione del cromosoma 2 all’interno del gene BCL11A, una regione intergenica tra i geni HBS1L e MYB sul cromosoma 6, e varianti all’interno del locus della β-globina sul cromosoma 11. Studi recenti che hanno mappato più finemente queste varianti genetiche suggeriscono che >50% della variazione dei livelli di HbF può essere spiegato da una variazione comune a questi tre loci (Galarneau et al. 2010). Sebbene si pensi che i livelli di HbF abbiano una componente genetica ereditabile nell’ordine del ∼80%, è importante tenere presente che la variazione genetica additiva trovata dalle varianti genetiche comuni ignora potenziali interazioni genetiche di ordine superiore che potrebbero non essere rilevate e quindi la misura in cui i livelli di HbF sono determinati geneticamente rimane da esplorare in studi futuri (Zuk et al. 2012).

L’osservazione iniziale di varianti associate ai livelli di HbF all’interno del fattore di trascrizione zinc-finger BCL11A ha portato a un primo studio che ha perseguito l’ipotesi che BCL11A possa essere un regolatore dell’espressione di HbF (Sankaran et al. 2008). Lavori precedenti avevano suggerito che BCL11A era un regolatore trascrizionale critico coinvolto nella linfopoiesi B e nella neurogenesi (Sankaran et al. 2010). I livelli di proteina BCL11A sembravano correlare con lo stadio di sviluppo dell’espressione, così che le cellule eritroidi primitive e fetali definitive del fegato che esprimevano alti livelli di γ-globina, avevano un’espressione bassa o assente delle forme full-length di BCL11A. Questo risultato ha suggerito che questo prodotto genico stava agendo come un repressore dei geni della γ-globina. Per testare direttamente questo, il knockdown di BCL11A usando approcci di short-hairpin RNA (shRNA) è stato eseguito in progenitori eritroidi adulti primari e l’espressione della γ-globina potrebbe essere indotta in modo robusto su tale knockdown. Il grado di induzione della γ-globina sembrava essere correlato all’estensione del knockdown di BCL11A. È interessante notare che importanti perturbazioni nell’eritropoiesi non sembrano verificarsi nonostante la robusta induzione di γ-globina osservata. Studi successivi hanno mostrato risultati simili quando si abbatte l’espressione di BCL11A usando shRNA (Borg et al. 2010; Zhou et al. 2010; Wilber et al. 2011). È stato inoltre dimostrato che BCL11A interagisce direttamente con la cromatina nel locus della β-globina umana in cellule eritroidi primarie e che sembra agire come parte di un complesso con il fattore di trascrizione GATA1 e il complesso di rimodellamento della cromatina e repressore NuRD (Sankaran et al. 2008). È interessante notare che il complesso NuRD contiene le HDAC 1 e 2, che sono state indicate come le HDAC critiche necessarie per il silenziamento di HbF (Bradner et al. 2010). Inoltre, è stato suggerito che il fattore di trascrizione SOX6 può cooperare con BCL11A per aiutare a silenziare i geni della γ-globina negli esseri umani e può essere essenziale per legare il promotore prossimale di questi geni della globina (Xu et al. 2010).

Anche se la commutazione dell’emoglobina nei modelli murini, anche quelli che ospitano un transgene umano del locus della β-globina, sembra divergere dalla normale ontogenesi dell’espressione della globina vista nell’uomo, un ruolo evolutivamente conservato di BCL11A nel silenziamento e nella commutazione del gene della globina è stato dimostrato nei topi (Sankaran et al. 2009; McGrath et al. 2011). I topi privi di BCL11A sembrano avere un’eritropoiesi normale, ma non riescono a silenziare completamente i geni globinici embrionali nelle cellule eritroidi definitive e permettono una certa espressione persistente della γ-globina quando il locus intatto della β-globina umana è presente. Questi risultati rafforzano l’importanza di BCL11A come mediatore critico della commutazione della globina nei mammiferi. Anche se questo studio iniziale ha affrontato il ruolo di BCL11A nel processo di sviluppo della commutazione della globina nei topi (Sankaran et al. 2009), uno studio più recente ha utilizzato l’inattivazione condizionale di BCL11A per dimostrare che l’inattivazione inducibile può risultare in estensioni robuste e simili di induzione del gene γ-globina come si verifica quando l’inattivazione si verifica in momenti precedenti (Xu et al. 2011). Inoltre, anche se c’è una regolazione differenziale dei geni della globina tra gli esseri umani e i topi, l’inattivazione di BCL11A ha dimostrato di essere sufficiente a migliorare le caratteristiche ematologiche e patologiche viste in modelli murini di malattia falciforme, fornendo un’importante prova di principio per la potenziale efficacia del targeting BCL11A per indurre HbF (Xu et al. 2011).

I meccanismi esatti attraverso i quali BCL11A silenzia l’espressione del gene γ-globina rimangono poco chiari. Uno studio recente suggerisce che questo può essere mediato attraverso entrambe le interazioni con i fattori di trascrizione, come SOX6 che legano la cromatina ai promotori prossimali della γ-globina, così come attraverso interazioni a lungo raggio con una varietà di regioni in tutto il cluster del gene della β-globina (Xu et al. 2010). Quando BCL11A è assente, la conformazione del locus della β-globina cambia in modo tale che l’enhancer a monte noto come regione di controllo del locus è giustapposto ai geni della γ-globina attivati trascrizionalmente. Un fenomeno simile si verifica quando le cellule sono trattate con inibitori HDAC che inducono l’espressione del gene γ-globina (Bradner et al. 2010). Tuttavia, non è chiaro se queste alterazioni conformazionali sono direttamente mediate da BCL11A o se queste alterazioni si verificano secondariamente all’effetto induttivo HbF dell’inibizione di BCL11A (o HDAC). Tuttavia, questi risultati supportano fortemente la nozione che BCL11A sembra avere un ruolo diretto nel silenziamento dell’espressione della γ-globina all’interno del locus della β-globina. Mappando una varietà di delezioni all’interno del locus della β-globina umana che risultano in δβ-talassemia, con modesti aumenti di HbF e qualche residuo squilibrio della catena globinica presente, o HPFH, con robusti aumenti di HbF e sintesi equilibrata della catena globinica, è stato dimostrato che una regione N3-kb a monte del gene δ-globina è necessaria per il silenziamento dei geni della γ-globina (Fig. 2) (Sankaran et al. 2011c). È interessante notare che questa regione ospita siti di legame per BCL11A, insieme ai suoi partner come GATA1 e HDAC1. Da notare che questa regione è stata anche indipendentemente implicata come importante per il silenziamento della γ-globina attraverso studi sulla delezione Corfu talassemia negli esseri umani (Chakalova et al. 2005). Questo studio fornisce importanti intuizioni meccanicistiche su come BCL11A funzioni per silenziare HbF e rafforza l’importanza delle mutazioni umane naturali nella comprensione di questo processo di sviluppo che è unico per gli esseri umani (Fig. 2) (Sankaran et al. 2011c).

Viste queste scoperte, BCL11A è probabilmente un importante bersaglio terapeutico. Il fatto che la sua inattivazione induce HbF senza provocare una grande perturbazione nell’eritropoiesi è molto promettente, anche se è noto che ha effetti importanti in altri lignaggi come i linfociti B, sottolineando l’importanza della modellazione e dell’analisi in vivo come parte degli sforzi in corso per indirizzare BCL11A per l’induzione HbF. Ulteriori studi che esplorano i meccanismi d’azione con cui funziona BCL11A potrebbero portare ad approcci migliori e più specificamente mirati per l’induzione di HbF (Sankaran et al. 2011c). SOX6 può anche essere un bersaglio potenzialmente promettente per l’induzione di HbF (Xu et al. 2010), anche se è noto che è necessario per la normale eritropoiesi (Dumitriu et al. 2006). Tuttavia, è stato riportato un paziente con una interruzione eterozigote di SOX6 che non ha avuto elevati livelli di HbF, suggerendo che il gene SOX6 può avere un meccanismo di compensazione del dosaggio o che ci può essere una soglia particolare necessaria per ridurre l’espressione di questo gene per avere robusta induzione HbF (Sankaran et al. 2011a). Questo suggerisce che ci possono essere dei limiti nel considerare SOX6 come un potenziale bersaglio per l’induzione di HbF.

Seguendo gli studi iniziali su BCL11A, due studi hanno suggerito che l’espressione di BCL11A sembra essere controllata dal fattore di trascrizione specifico eritroide KLF1 usando approcci indipendenti e complementari. In uno studio, un topo con un allele ipomorfo di KLF1 ha prodotto un aumento dell’espressione embrionale della globina e i topi transgenici con il locus della β-globina umana hanno mostrato un’espressione persistente della γ-globina (Zhou et al. 2010). Di conseguenza, i ricercatori hanno testato se la stessa regolazione potrebbe verificarsi in cellule eritroidi umane primarie e potrebbero mostrare una connessione simile utilizzando approcci shRNA. I ricercatori hanno poi dimostrato che questo effetto si verifica sia attraverso effetti diretti di KLF1 al locus della β-globina, ma anche attraverso effetti indiretti mediati dalla ridotta espressione di BCL11A su KLF1 knockdown. Questo risultato ha dimostrato che KLF1 è un regolatore trascrizionale positivo diretto dell’espressione di BCL11A. Un secondo gruppo ha esaminato le basi genetiche di una forma non collegata di HPFH che è stata suggerita come risultato di una mutazione missenso di KLF1 in questa famiglia (Borg et al. 2010). I ricercatori hanno potuto dimostrare, utilizzando cellule primarie di questi pazienti e di controlli non affetti, che l’effetto visto era in parte attribuibile ad un effetto di silenziamento di KLF1 su BCL11A. Un’area di incertezza continua riguarda i fenotipi umani visti con vari casi di mutazioni KLF1. Anche se nel rapporto iniziale, tutti i destinatari della mutazione missenso hanno avuto aumenti nell’espressione HbF, va notato che questo in realtà variava tra il 3% e il 19% dei livelli di emoglobina totale. Inoltre, altri rapporti di mutazioni KLF1 eterozigote nell’uomo mostrano un’interruzione concomitante dell’eritropoiesi o uno scarso effetto sull’espressione di HbF (Arnaud et al. 2010; Satta et al. 2011). Studi più recenti suggeriscono che le rare varianti di KLF1 sono effettivamente associate ad aumenti di HbF, ma questo non sembra verificarsi in modo coerente o nella stessa misura anche con mutazioni simili (Gallienne et al. 2012). La base di questa variazione deve ancora essere determinata e sarà importante comprendere meglio i meccanismi attraverso i quali KLF1 agisce sia direttamente che indirettamente, per influenzare l’espressione di HbF. Questo sarà fondamentale per qualsiasi lavoro futuro che tenterà di colpire KLF1 per l’induzione di HbF, in particolare se si vogliono evitare gli effetti negativi di tale inibizione sulla differenziazione eritroide. Tuttavia, data la specificità di KLF1 all’interno del lignaggio eritroide e se l’attività di regolazione del gene della globina di KLF1 potesse essere specificamente mirata, dovrebbe ancora essere considerato un candidato per indurre HbF.

Oltre alle varianti genetiche comuni identificate in BCL11A associate ai livelli di HbF nell’uomo, gli studi GWAS hanno mostrato che ci sono varianti sul cromosoma 6 intergeniche tra i geni HBS1L e MYB che sembrano avere un effetto drammatico sui livelli di HbF nell’uomo (Menzel et al. 2007; Thein et al. 2007; Lettre et al. 2008; Uda et al. 2008). Comprendere il meccanismo d’azione con cui queste varianti determinano alterazioni nei livelli di HbF è importante, poiché le varianti genetiche in questo locus sembrano avere un effetto altrettanto grande o forse anche maggiore sulla morbilità clinica nelle β-emoglobinopatie come quelle varianti al locus BCL11A (Galanello et al. 2009; Nuinoon et al. 2010). È interessante notare che questa regione contiene una varietà di elementi regolatori che sono stati suggeriti per avere un ruolo importante nella regolazione dell’espressione di MYB nei progenitori eritroidi (Mukai et al. 2006; Wahlberg et al. 2009; Stadhouders et al. 2011). Anche se la sovraespressione di HBS1L non sembra avere effetto sull’espressione della γ-globina nelle cellule eritroleucemiche K562, la sovraespressione di MYB sembra influenzare il livello di γ-globina prodotta in queste cellule (Jiang et al. 2006). Inoltre, le colture di progenitori eritroidi primari di esseri umani con una maggiore espressione di HbF avevano più spesso una ridotta espressione di MYB (Jiang et al. 2006).

Seguendo la classica osservazione clinica che i pazienti con una trisomia del cromosoma 13 hanno un ritardo nella commutazione dell’emoglobina da feto ad adulto e continuano ad avere una persistente espressione di HbF (Huehns et al. 1964; Sankaran e Sapp 2012), studi recenti hanno fornito ulteriori prove di un ruolo di MYB nella regolazione dell’espressione HbF. Con la mappatura fine e l’esecuzione di un’analisi genomica integrativa dei geni in una regione del cromosoma 13 implicata come necessaria per l’aumento di HbF osservato nei pazienti con trisomie parziali del cromosoma 13, si è scoperto che c’erano due piccole molecole di RNA ∼22 nucleotidiche che erano i migliori candidati per svolgere tale attività, i microRNA 15a e 16-1 (Sankaran et al. 2011b). La sovraespressione di questi microRNA nelle cellule eritroidi adulte primarie in coltura ha portato ad un aumento della produzione di γ-globina. Esaminando i bersagli di questi microRNA, si è notato che uno dei bersagli principali nelle cellule eritroidi era MYB. L’abbattimento diretto di MYB nei progenitori eritroidi adulti primari ha portato ad un drammatico aumento della produzione di γ-globina (Sankaran et al. 2011b), collegando questa osservazione storica da una rara sindrome umana di aneuploidia al lavoro più recente che esamina i meccanismi molecolari che regolano i livelli di HbF.

Il meccanismo con cui MYB può agire per regolare i livelli di HbF rimane poco chiaro. Questo può essere dovuto ad un effetto sulla cinetica di eritropoiesi o in alternativa può anche verificarsi come risultato di un effetto diretto all’interno del locus β-globina (Higgs e Wood 2008). Ulteriori lavori saranno necessari per esplorare tali meccanismi e sono molto promettenti nei tentativi di colpire terapeuticamente questa molecola per l’induzione di HbF. C’è la preoccupazione che il targeting di MYB possa avere effetti collaterali indesiderati, in particolare dato il ruolo pleiotropico di MYB nell’emopoiesi (Emambokus et al. 2003; Carpinelli et al. 2004). Tuttavia, un lavoro recente suggerisce che tali strategie possono effettivamente essere promettenti, perché l’abbattimento parziale di Myb nei topi ha avuto poco effetto sulla normale ematopoiesi in vivo, bloccando drammaticamente la progressione delle leucemie (Zuber et al. 2011a). Pertanto, l’inibizione parziale di MYB può essere promettente come una valida strategia per l’induzione di HbF. L’additività degli effetti delle varianti nella regione intergenica HBS1L-MYB insieme alle varianti del locus BCL11A (Lettre et al. 2008; Galanello et al. 2009; Nuinoon et al. 2010) suggerisce che il targeting di entrambi questi percorsi insieme potrebbe produrre effetti ancora più robusti rispetto al targeting di uno dei percorsi da solo.

Anche se i regolatori della regolazione di HbF discussi sopra sono stati trovati attraverso studi genetici umani, confermando così la loro rilevanza in vivo negli esseri umani, una varietà di altre molecole sono state suggerite per svolgere un ruolo nella regolazione del gene della γ-globina attraverso vari studi utilizzando approcci di coltura cellulare o con modelli murini (Tabella 1). Queste molecole saranno discusse di seguito. È importante tenere a mente che ci sono limiti per la maggior parte dei sistemi sperimentali attualmente disponibili utilizzati per studiare la regolazione del gene della γ-globina. Le cellule eritroidi umane primarie sembrano essere permissive alla manipolazione che permetterà aumenti nella produzione di γ-globina, che potrebbe non essere sempre rilevante negli esseri umani in vivo. Inoltre, molti degli stimoli che sono noti per indurre la produzione di γ-globina in vivo negli esseri umani, compresi vari tipi di eritropoiesi da stress e il trattamento con idrossiurea, non funzionano per indurre la produzione di γ-globina in modelli murini umanizzati (Pace et al. 1994; Sankaran et al. 2009) sottolineando un importante limite per interpretare i risultati negativi in questo sistema sperimentale. Pertanto, la cautela deve essere esercitata quando si interpretano i risultati sperimentali non supportati da prove da studi genetici umani o studi effettuati in esseri umani o primati in vivo.

Esaminando le proteine che legano gli elementi di ripetizione diretta presenti nel promotore dei geni della γ-globina, i recettori orfani degli ormoni nucleari TR2 e TR4 sono stati suggeriti per svolgere un ruolo come repressori dell’espressione dei geni della γ-globina (Tanabe et al. 2002, 2007; Cui et al. 2011). Paradossalmente, la sovraespressione di TR2 e TR4 in modelli di topi transgenici si traduce in un’elevata espressione di γ-globina e quando viene sovraespressa in modelli di topi malati di falcemia può portare ad un parziale miglioramento dei sintomi ematologici e patologici di questi topi (Campbell et al. 2011). I meccanismi alla base di queste osservazioni e la rilevanza per la regolazione del gene globina umana rimane da stabilire per TR2 e TR4. Inoltre, il recettore nucleare orfano dell’ormone nucleare COUP-TFII è stato anche suggerito per legarsi alle ripetizioni dirette e reprimere il promotore della γ-globina negli esseri umani (Filipe et al. 1999). Utilizzando colture in vitro di cellule eritroidi adulte primarie, è stato dimostrato che citochine come SCF sembrano down-regolare l’espressione e l’occupazione della cromatina di COUP-TFII al locus della β-globina, con conseguente aumento dell’espressione della γ-globina (Aerbajinai et al. 2009). Inoltre, la down-regolazione diretta di COUP-TFII usando piccoli RNA interferenti (siRNA) potrebbe risultare in un aumento della produzione di γ-globina (Aerbajinai et al. 2009). Ulteriori studi sul ruolo di COUP-TF nella regolazione di HbF saranno necessari per capire meglio il suo ruolo fisiologico negli esseri umani.

Studi recenti hanno anche suggerito un ruolo per il gene chiamato amico di PRMT1 (FOP1) nella repressione dell’espressione genica della γ-globina (van Dijk et al. 2010). Il knockdown di FOP1 risulta in un’elevata espressione di HbF in cellule eritroidi umane adulte in coltura. È stato suggerito che questo sia mediato da una ridotta espressione di SOX6, il cui knockdown è noto per provocare anche un aumento della produzione di γ-globina (Xu et al. 2010). Ulteriori lavori saranno necessari per confermare questi risultati, capire se questo gene ha anche un ruolo nell’eritropoiesi più in generale, ed esaminare il meccanismo alla base di queste osservazioni.

Alcuni studi hanno anche suggerito un ruolo per la proteina selettore di stadio NF-E4 come attivatore dell’espressione della γ-globina negli esseri umani (Jane et al. 1995; Zhao et al. 2006). È stato suggerito che una forma breve di NF-E4 può avere un ruolo nel reprimere i geni della γ-globina inibendo la normale funzione attivante di NF-E4 al promotore di questi geni (Zhou et al. 2004). Tutti questi studi si sono basati su esperimenti eseguiti in cellule coltivate e sulla purificazione biochimica dei complessi proteici dalle cellule K562 e quindi saranno necessari ulteriori lavori per confermare il ruolo fisiologico di questo gene nell’espressione della γ-globina e comprendere meglio i meccanismi attraverso i quali questo complesso può agire per alterare la regolazione del gene della globina umana.