Pathogenesis In Vitro
Columnar epithelial cellは、一度に二つの極端なpHを経験する死角細胞である。 先端側では高アルカリ性の腸液に、底部では弱酸性の血液リンパ液に浸かっている。 このような条件は細胞培養では再現しにくく、この事実が一次感染に関する情報の少なさの原因となっている可能性がある。 その結果、GV の感染メカニズムについては、ODV の感染についてよりもほとんどわかっていない。 しかし、GVのヌクレオカプシドが形成される際に、宿主細胞の核膜が崩壊することが分かっている。 核膜の消失は特徴的であり、NPV感染宿主細胞では起こらない。
NPV感染を支持する昆虫細胞株が数多く確立されている。 細胞株の多くはイモムシの卵巣や胚に由来するものである。 AcMNPVは、いくつかの昆虫種に由来する細胞株で複製することができ、この事実が、最もよく研究されているバキュロウイルスであることに寄与している。 標準的な1段階の成長曲線では、AcMNPVのBVは通常、感染後12〜20時間（hpi）、そして閉塞は20〜48時間（hpi）で産生される。
AcMNPV BV は、主にその融合タンパク質である GP64 の存在により、ODV より 1000 倍も感染力が強い。 BVはクラスリンを介したエンドサイトーシスによって標的細胞に入る。 BVのヌクレオカプシドは、エンドソームから放出されることにより、標的細胞の細胞質深部へと侵入する。 BVヌクレオキャプシドは、細胞膜の下にある危険な環境を回避し、細胞膜での融合よりも核の近くにまで入り込むことができるのである。 BV融合タンパク質が経験するpH感受性の構造シフトは、ウイルスエンベロープとエンドソーム膜の間の融合イベントの引き金となる。
AcMNPV ヌクレオキャプシドがエンドソームから脱出すると、すぐにF-アクチンケーブルと結合する。 ケーブルの形成は一過性で、ウイルスのヌクレオカプシドが核に移動し、入るまでの間に起こる。 その際、ヌクレオカプシドの基部に存在すると考えられているF-actin結合タンパク質P78/83を介して、アクチンケーブルの一端と共局在化することが考えられる。
NPVや一部のGVのヌクレオキャプシドは核膜孔を通って核内に侵入する． いくつかのGVは核膜孔でアンコーティングするが、ほとんどのバキュロウイルスのアンコーティングは核の中で起こる。 初期の遺伝子転写は、宿主のRNAポリメラーゼII（Pol II）を介して、直ちに始まる。 初期に発現する遺伝子のうち、核内へのG-アクチンの効率的な輸送と蓄積をもたらすサブセットがある（図5）。 このアクチン局在化の壮大な操作は、NPVの子孫の生産に不可欠であり、他の病原体では報告されていない。 一過性のトランスフェクション実験で同定されたアクチンの核内局在に関わる遺伝子は、ie1、pe38、Ac004、Ac152、he65、およびAc102である。 ie1とAc102の2つの遺伝子は、すべての鱗翅目NPVとGVの間で保存されており、どちらも必須である。
Figure 5. AcMNPV感染細胞における核内G-アクチン。 (a) 4′,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)で染色した感染細胞；(b) トランスフェクションした緑色蛍光タンパク質（GFP）-アクチンを発現している感染細胞。 (c)核のローダミンファロイジン染色の欠如は、核アクチンが単量体であることを示す。
感染後期への移行はBV子孫生産期間の始まりであり、細胞活動は最大速度でウイルス成分を合成することに向けられ、それらを核酸カプセル生成物に組み立て、そしてそれらを輸送している。 この時期、宿主の高分子合成は停止するが、宿主のクロマチン構造は細胞死まで無傷のままである。 後期および超後期のウイルス遺伝子は、ウイルスがコードするRNAポリメラーゼによって発現する。
感染初期に再構成された微小管は、後期には生成する因子によって解重合し、細胞が丸くなる（図6）。 同様に、初期に核内に蓄積されたG-actinは後期に重合し、核の膨張と同時に目に見える宿主核構造の消失が起こる(図7)。 ウイルスDNA合成の場であるウイルス原性ストロマは、核の中心に形成され、「リングゾーン」と呼ばれる電子的に透明なゾーンが点在し、その周囲には、ゲノムロード中にカプシドが組み立てられ繋ぎとめられる場所である。 核のF-アクチンはリングゾーンで主要なAcMNPVキャプシドタンパク質と共局在化する（図7）
図6.核のF-アクチンはリングゾーンで主要なAcMNPVキャプシドタンパク質と共局在化する。 細胞障害効果 (CPE) のさまざまな段階を示す AcMNPV 感染 Sf21 細胞。 (a)未感染細胞。 紡錘形とヌクレオクロマチン構造の存在に注意。 (b) 初期および後期のCPEを示すAcMNPV感染細胞。 細胞は微小管の脱重合により丸みを帯び、核は大きくなって宿主構造を取り除き、ウイルス原性間質（vs）はリングゾーン（rz）に囲まれている。 ウイルス原性ストロマは、感染後期が進むにつれて密度が高くなる。 感染超後期には多面体が核を埋める（p）。
図7. 遺伝子発現後期のAcMNPV感染細胞における核内F-アクチン。 (a)DAPI染色は核の位置を示す。 (b）緑色蛍光は、カプシドタンパクが主に核のリングゾーンに局在していることを示す。 (c) ローダミンファロイジン染色は、F-アクチンがリングゾーンでカプシドと共局在することを示す。
核のF-アクチンはBV生成に必要である。 F-actinを破壊する薬剤の存在下では、ウイルスカプシドは奇形で、電子密度の高い物質のパッチがまれにある核内膜に並置された長い管状構造として現れる。 通常存在するベースプレートやキャップ構造は見られず、膜状のプロファイルが過剰に生成される。 ウイルスDNA合成は通常の速度で行われるが、ゲノムはパッケージ化されず、ウイルス原性ストロマは通常のストロマと比較して「弛緩」した外観を呈する。 興味深いことに、AcMNPV very late factor-1 (VLF-1) がない場合の表現型も同様であり、VLF-1がキャプシドのウイルス原性ストロマへの繋留に関与している可能性があり、F-アクチンが、キャプシドが直接的または間接的に付着するストロマの構成要素であることが示唆される。
P78/83, 感染時に遅れて発現するマイナーキャプシド蛋白質が AcMNPV viability にとって必須である。 この特徴は30年以上前に注目され、最初の商用バキュロウイルス発現キットに利用された。 P78/83（非リン酸化時78kDa、リン酸化時83kDa）は、BVとODVの両方のキャプシドのベースプレートの一部であると考えられている。 P78/83はF-actin結合タンパク質であり、この活性は集合中にキャプシドを核マトリックスに繋ぎとめるのに役立つと考えられる。 興味深いことに、P78/83は、それが必須である理由を説明する別の活性を有している；それは核内のアクチン重合を促進することである。 P78/83は、アクチンフィラメントの核形成を促進する因子であるウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質（WASP）ファミリーに保存されているドメインを含んでいる。 WASPファミリーメンバーは、アクチン関連タンパク質（Arp）-2/3複合体のアクチン核形成活性を正に制御している。 真核生物間で保存されているこの7つのサブユニット複合体は、AcMNPV感染細胞において核に移動し、P78/83によって活性化される。 アクチン核形成の促進能力の低下をもたらすP78/83の変異は、感染性BVの生産能力の低下をもたらす。
核内に侵入した直後、AcMNPV DNAはヌクレオソーム様構造をとり、ゲノム複製においてヌクレオソームとヌクレオソーム関連プロセスを利用する。 したがって、ウイルスの複製戦略の一環として、宿主のクロマチンリモデリング能力の一部（全部ではないにせよ）をハイジャックしているように思われる。 最近の研究から、BRO（baculovirus repeated orf）ファミリーのタンパク質がこのプロセスに関与している可能性が高いことが示唆されている。 BROタンパク質は感染初期に発現し、一本鎖DNA（ssDNA）およびコアヒストンと結合し、分画実験ではヒストンと分配される。 BmNPV、orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus、lymantria dispar multiple nucleopolyhedrovirusはいずれも複数のbro遺伝子を持っている。 AcMNPVはBmNPVのbro-dに関連する1つのbro遺伝子のみを持ち，これは必須である。
AcMNPVがコードする高度に基本的なゲノムパッケージング蛋白質であるP6.9は感染後期に蓄積し始め，別のクロマチン構造が現れる。
P6.9 -DNA相互作用はP6.9のリン酸化状態により制御されている． ゲノムパッケージング中、ウイルス原性ストロマからのゲノムDNAは、P6.9が脱リン酸化されるとP6.9と結合し、円錐端構造の開口部から予め形成されたキャプシド鞘に凝縮される。 円錐形構造はウイルス原性間質の近位に位置し、遠位には電子密度の低い空間であるリングゾーンに伸びるベースプレートによってキャップされたキャプシド鞘がある。 リングゾーンでは、F-アクチンとキャプシドタンパク質が、P78/83とArp2/3複合体とともに共局在している。 F-actinを破壊する薬剤やVLF-1の不在によって影響を受けるのはこの複製段階である。
感染後期段階の開始とともに、BV産生の減少があり、ODV産生の開始がある。 新しく組み立てられたヌクレオカプシドは核内にとどまり、核内膜に由来すると思われるエンベロープに包まれる。 エンベロープを形成したビリオンは、未形成のヌクレオカプシドではなく、タンパク質マトリックスに包まれてカプセルまたは多面体を形成する。 細胞は最終的に溶解し、莢膜を培地中に放出する
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