Common ancestry of heterodimerizing TALE homeobox transcription factors across Metazoa and Archaeplastida

Archaeplastida のTALEは2グループに分類される． KNOXとnon-KNOX

利用可能なすべてのホメオボックスタンパク質配列を収集するために、Archaeplastida全体の非植物ゲノムおよびトランスクリプトームアセンブリに対してBLASTおよびPfam-モチーフ検索を行い、56種から338のタンパク質をArchaeplastida homeobox collectionとして特定した（30ゲノムと18トランスクリプトーム）。 追加ファイル1: 表S1）。 このうち104個がTALEタンパク質の特徴であるホメオドメインの23-24番目のアミノ酸の挿入を有していた。 また、TALE遺伝子は、緑藻類のTrebouxiophyceaeの5ゲノムを除くほとんどのゲノムで少なくとも2つ検出された（Additional file 1: Table S1、TrebouxiophyceaeにTALEがないことについては、Additional file 2: Note S1参照）。

次に、収集したTALE配列を、動物、植物、および初期分岐真核生物（アメーバ動物およびエクスカバータ）のTALEをアウトグループとして、系統的アプローチによりホメオドメインの特徴によって分類した（追加ファイル3：図S1）。 その結果、TALEホメオドメイン系統は、古細菌門の3つの系統全てにおいて、2つのグループに区別された（図2）。 (1）よく支持されたクレードとしてのKNOXグループは、門特異的なクラドグラムを示した。基部にある2つの緑藻類の配列（KNOX-Glaucoとして）は、次のクレードとは別であり、ロード植物配列（KNOX-Red1として）と強い支持を持つViridiplantae特異的クレードとを結合した（92/90/1.00)。 (2)BELLやGSP1ホモログを含む非KNOX群には、分類学的所属が混在するクレードが存在した。 これらの解析から、TALEタンパク質は古細菌の進化以前に既に2つのグループに分岐していたこと、そしてKNOXグループは古細菌全体で高度に保存されていることが示された

ArchaeplastidaにおけるTALEスーパークラスのホメオドメインの最尤法（ML）系統はKNOX-と非KNOX TALEグループの古代の分割を支持した。 ML樹は70アミノ酸位置のホメオドメインのアライメントから作成された。 1000本のブートストラップによるコンセンサスツリーが示されている。 クリティカルノードの3つの数字は、クレードを支持する%bootstrap, %SH, Bayesian posterior probabilityを示す。 この木には、ノードに黒い四角で示した2つのアウトグループと、赤い四角で示したほとんどのKNOX配列と青い四角で示したすべての非KNOX配列を組み合わせた2つのアルカプラスチダ・クレードが含まれている。 右側の縦棒は、黒がアウトグループ、赤がKNOX、青が非KNOX配列の分布を示す。 配列名横の赤い点はKN-AまたはKN-Bドメインの存在を、青い点はPBC-ホモロジードメインの存在を示す。 相同性ドメインの解析に利用できない切断配列は、開いた黒枠で示した。 黒枠はKN-A/BまたはPBC-ホモロジードメインがないことを示す。 提案された分類は縦線で示されている。 点線の縦線は、系統学上、そのクラスの主要なクレードの外に位置するクラスメンバーが提案されていることを示す。 PBX-Red配列は4つのクレードに分かれており、縦棒の青色部分に紫色のシェードで示されている。 紫色の四角で示した2つのPBX-Red配列はKNOX-Red1クレードに例外的に存在し、そのホメオドメインのTrp19, His23, Lys31の保存度の高い位置に分岐したアミノ酸を持っており、KNOX-Red1との誤った関連性を示唆するものであった。 配列名の色は系統群を示す。 青色は芒植物、紫色は菱形植物、緑色は原始植物、水色は葉緑素、オレンジ色は連鎖植物、黒色はアウトグループである。 定規は遺伝的距離を示す。 この系統樹で解析した配列の詳細は、Additional file 1: Table S2 に記載されている。 *Gloeochaete_wittrockiana_014496はMMETSP1089のトランスクリプトームの原培養物（SAG46.84）を汚染したバナリード型アメーバからの配列と考えられる。 **KNOX-Red2クラス配列とAmorphea PBC配列の関連は、収斂進化を介してホメオドメインのDNA結合特異性を決定する共有WFGNモチーフに起因する

KNOXグループ配列はArchaeplastida全体で同じヘテロ二量化ドメインを共有

次の質問は、植物KNOXクラスの起源がVirusiplantae門よりも先にあったかどうかであった。 植物のKNOXタンパク質と葉緑体のGSM1は、他のTALEタンパク質とのヘテロ二量化に必要なKN-A, KN-B, ELKドメインからなるKNOX相同性を有しており、KNOXグループへのヘテロ二量化の可能性が示唆された。 そこで、事前に情報を得ることなく、KNOXグループの配列からアドホックに相同性検索を行い、相同性ドメインを収集した。 同定された相同ドメインをアンカーとして、KNOX グループ配列と KNOX 相同性を持つ他の TALE 配列とのアライメントを慎重に作成した（Additional file 3: Figure S2）。 このKNOX配列のアラインメントから、KNOXホモロジー領域を構成する3つのドメインのうち少なくとも2つについて、アミノ酸類似度スコア> 50%を示すすべてのKNOXグループ配列（部分配列を除く）を見出した（ドメインの相同性計算については追加ファイル 1: 表S3）。 この類似性がTALE配列に特異的であるかどうかを検証するために、KNOXアライメントからKN-AおよびKN-BドメインのHMMモチーフを生成し、標的ゲノムで検索したところ、KN-AおよびKN-BドメインはTALE配列にのみ見出されることを確認した（追加ファイル4：データS1およびデータS2）。 これにより、検索可能なKNOX相同性を有するTALE配列をKNOXホモログと定義し（図2、IDの後に赤い点で示す）、古細菌に代表される真核生物の光合成の進化以前からKNOXホモログが存在していたことが示唆されました。

また、同じ検索で、KNOX-homologyに加えて、ホメオドメインのC末端に2つの新規ドメインを発見した（追加ファイル3：図S2）。1つ目（KN-C1）はChlorophyta配列に共通し、2つ目（KN-C2）はKNOXグループ以外のクレードのKNOXホモログ群（KNOX-Red2）で共通していた。

藻類門の間でKNOXクラスは独立して分岐していた

Viridiplantaeでは、ほとんどのChlorophyta種で単一のKNOXホモログが見つかったが、KNOX1およびKNOX2の分岐は、炭藻類Klebsormidium flaccidumや陸生植物などStreptophyta部門で顕著であった（Fig.2）。 新たに発見されたKN-C1ドメインは、葉緑体KNOX配列に特異的で、1種（Pyramimonas amylifera）を除くすべての種で見いだされた。 KN-C1とKNOX1/KNOX2配列のC末端拡張部との間に類似性がないことから、葉緑体および茎葉体における独立した系統特異的なKNOXの進化が示唆された（追加ファイル3：図S2）。

ロドフィータにおけるKNOXホモログは，KNOX-Chloroクレードに近いパラファイオティックなグループ（KNOX-Red1）と，PBX-Outグループに近い第2のグループ（KNOX-Red2）に分けられた． KNOX-Red1はKN-Aを欠き、KNOX-Red2はELKを欠き、KN-C2ドメインを共有していた（Additional file 3: Figure S2）。 KNOX-Red1の配列は調べたすべてのロドフィータ分類群に見られたのに対し、KNOX-Red2の配列は2つの分類群（藍藻綱と花藻綱）に限られていたことから、KNOX-Red1を祖型とみなした。 興味深いことに、KNOX-Red2クレードには2つの緑藻類配列が含まれ、強い統計的支持（89/89/0.97；図2）；これらはKN-C2ドメインを持っており、KNOX-Red2クラス内に祖先を持つことを示唆した（追加ファイル3：図S2；水平遺伝子転移による可能性に関するさらなる議論は追加ファイル2：注S2参照）

TALE配列は緑藻類の場合限られたものだった。 その結果、KN-AドメインとKN-Bドメインを持ち、ELKドメインを持たないKNOXホモログを2種で見出した。

非KNOXグループのTALEは動物型のPBC-homologyドメインを持ち、古細菌とメタゾアの祖先を共有していると考えられる

KNOXホモログを特定した後、残りのTALE配列を古細菌のKN-AとKN-Bドメインを欠いた非KNOXグループとしてまとめた。 非KNOXグループの更なる分類は、ホメオドメインの配列が非常に多様であるため、困難であった。 しかし、種ごとの非KNOX遺伝子の数はほぼ一定であり、ほとんどのロードフォフィタとグロウソフィタゲノムに1つ、大部分のクロロフィタゲノムに2つあり、それぞれの放射線内で保存されていることが示唆された

アドホック相同性検索により、非KNOXの分類に不可欠な情報が得られ、全てのロードフォフィタの非KNOX配列に共通する相同性ドメイン（図3a、b）を特定した。 このドメインは動物のPBC-Bドメイン（Pfam ID: PF03792）の後半部分（ヘテロ二量化ドメイン）と類似していることから、このドメインをPBL（PBC-B Like）と命名した。 そこで、芒植物と紅藻の非KNOX型TALEをPBX-GlaucoまたはPBX-Redという1つのPBC関連ホメオボックスクラスに分類することにした。 PBX-Glaucoは動物のPBC-Bドメインに保存されているMEINOXモチーフを持ち、PBC-BとPBLドメインの共通祖先を示唆する（図3a）。 3

GSP1はViridiplantaeの他の非KNOXグループ配列とPBC相同性を共有している

残る疑問は、明らかにPBC相同性を持たないChlorophyta非KNOX配列の進化であった。 そこで、新たに定義されたPBLドメインを、BLAST（カットオフE値1E-1）と多重配列アラインメントにより葉緑体配列と比較し、遠い相同性でも発見することにした。 この結果、MEINOXモチーフとPBLドメインを持つ原生生物TALE配列が3つ、葉緑体TALE配列が1つ得られたが、これらの配列の同一性は非常に低かった（図3c）。 これらの4つの配列をさらに照会したところ、さらに11の非KNOX配列が同定された。 これらのうち9つは、GSP1ホモログを含む配列と、ほとんどの原生生物配列を組み合わせた2つのアラインメントにした（Additional file 3: Figure S3）。 残りの2つの配列（Picocystis_salinarum_04995とKlebsormidium_flaccidum_00021_0250）はChondrus cruentumのPBX-Red配列（ID：41034）とPBLドメインから約200 aaの延長で相同性を示し、そのPBX-Redが祖先だと考えられた（水平転移の別の可能性；追加ファイル3；図S4）。 PBL-homologyドメインを持つ全ての非KNOX配列は、クラミドモナスのGSP1タンパク質をこのクラスの最初のメンバーとして認識し、GLX (GSP1-like homeobox) として分類された。

植物のBELLクラスは葉緑素のGLXクラスと相同性があるか？

BELLクラスは陸上植物で唯一の非KNOXクラスでPOX (Pre-homeobox) ドメイン (PF07526) を共有し識別できるPBLドメインを欠いています。 陸上植物が出現したチャロフィツムで利用可能な2つのゲノムのうちの1つであるK. flaccidumゲノムには3つの非KNOX配列があり、いずれもPBLドメインを有していた（図3、追加ファイル3：図S3、図S4）。 また、Chara brauniiの2番目の炭水化物ゲノムには、1つの推定BELLホモログが含まれていたが、不完全な遺伝子モデルのためか、C末端のホメオドメイン以外のN末端配列が切断されているようであった。 したがって、植物のBELLクラスがPBL-homologyを持たないのは、PBL-homologyを持つ古い炭藻類のクラスからの分岐またはドメインの喪失によるものと思われる。 また、K. flaccidum GLXホモログの24(2/3)ホメオドメイン位置にはイントロンが存在し、これは植物BELLクラスに特異的であることが既に同定されており（追加ファイル3：図S5）、植物BELLクラスは先祖のGLX遺伝子から進化したことが示唆された。

Two non-KNOX paralogs of Chlorophyta heterodimerize with the KNOX homologs

Chlorophyta non-KNOX sequenceの約半分では、相同性検索を行ってもPBC/PBL-相同性を特定することができなかった。 このように、ほとんどの葉緑体ゲノムがPBL相同ドメインを持たないGLXホモログと非KNOX配列を1つずつ持っているので、後者をまとめてクラスBと呼ぶことにした（追加ファイル3：図S6）。 例外は原始生物群（クラスMamiellophyceae）であり、その6つの高品質ゲノムはすべてPBL-homologyを欠く2つの非KNOX配列を含んでいた。 しかし、これらの非KNOX配列は2つのグループを形成しており、一方は保存性が高く、他方は保存性が低く多系統で、それぞれMam-Aクラス、Mam-Bクラスと呼ばれている（Additional file 3: Figures S7, S8）。 Mam-AクラスはMamiellophyceaeの還元的なゲノム進化を考慮すると，祖先のGLXクラスから派生した可能性がある

Chlorophytaにおける2つの非KNOXクラスの分岐は，その二次ネットワークについての重要な疑問を引き起こした。 TALEヘテロダイマーは動物ではMEISとPBCドメイン、クラミドモナスではKNOXとPBLドメイン間の相互作用を必要とすることがこれまでの研究で示されていた。 そのため、すべての緑藻類・褐藻類のTALEはKNOXとPBLの相同ドメインを介してヘテロダイマーを形成することが予想された。 一方、PBLドメインを持たないTALEが他のTALEとヘテロダイマーを形成することができるかどうかは、まだ検証されていない。

葉緑体におけるTALEクラスタンパク質の相互作用ネットワークを明らかにするため、Mam-AとMam-B遺伝子を持つ2種（Micromonas commodaとOstreococcus tauri）、および転写産物にGLXとクラスBが1つずつ含まれる別の種（Picocystis salinarum）を選び、タンパク質-タンパク質間相互作用アッセイを行った。 この3つの種すべてにおいて、KNOXホモログは、Mam-A, Mam-B, Class-B, GLXクラスで調べたすべての非KNOXタンパク質と相互作用することがわかった（図4a-c）。 つの非KNOXタンパク質間の相互作用は、3つの種のいずれでも観察されなかった（図4a-c）。 GLX-KNOXのヘテロダイマー化と同様に、Mam-AとMam-BもKNOXホモログとのヘテロダイマー化にはホメオドメイン以外のドメインを追加で必要とした（追加ファイル3：図S9）。 これらの結果から、分岐した非KNOX TALEはいずれもKNOXホモログとヘテロ二量体を形成する本来の活性を維持していることが明らかとなった。 図4

TALEのヘテロ二量化は真核生物の歴史の早い時期に進化した

我々が古細菌でPBC-homologyを見つけたことはメタゾアと古細菌間でTALEのヘテロ二量化の共通祖先を示唆している。 また、他の真核生物の系統にもPBC-homologyを持つTALESが存在する可能性があることが予想された。 しかし、Pfamデータベースには、PBC-Bドメインを保有する配列が2つしかなく、1つはCryptophyta（Guillardia theta, ID:137502 ）、もう1つはAmoebozoa（Acanthamoeba castillian, ID:XP_004342337 ）からのものであった。 さらに、真核生物の系統樹の根元に近いとされるエクスカバータグループを調べた。 Naegleria gruberiとBodo saltansの2つのゲノムを検索したところ、N.gruberiでは12個のTALEホメオボックス配列が、B.saltansでは1個も見つからず、そのうちPBCホモロジードメイン（ID：78561、図3a）とMEIS/KNOXホモロジー（ID：79931、追加ファイル3：図S2）1個の配列を発見した。 Amorpheaの追加ゲノムを検索したところ、Apusozoa, Ichtyhosporea, Choanoflagellataから収集したTALE配列にPBC-homologyとMEIS/KNOX-homologyを見つけたがFungiからは見つからなかった（Additional file 3: Figures S11-S14）。 この結果は、ヘテロ二量化ドメイン（PBC-ホモロジーとMEIS/KNOX-ホモロジー）が真核生物の進化の初期に誕生し、主要な真核生物の放射化を通じて持続したことを示唆している

Intron-retention supported the parallel evolution of heterodimeric TALE classes during eukaryotic radiations

2 型TALEが遍く存在していたことから次の疑問がわいてきた。 本研究で報告された二量体TALEはすべて単一の祖先の二量体の子孫なのか、それともヘテロ二量化を行わない単一の原型TALE（プロトTALE）からの系統特異的進化に起因するものなのかという疑問が生じた。 イントロンの保持は、長い間保存され、ホモプラシー（共通の祖先には存在しないが、ある種に見られる特徴）により発生する可能性が低いと考えられている。 このうち44/45と48(2/3)のイントロンは古細菌とメタゾア全体に存在するため、最も祖先に近いと考えられる（Additional file 3: Figure S5）。

44/45と48(2/3)イントロンは、各門の2つの二卵性パートナー間で、一方が44/45を、他方が48(2/3)イントロンを持つという興味深い排他的分布を示した（追加ファイル3: Figure S5）。 この相互排他的なパターンは、イントロンの位置が異なる2つのTALE遺伝子が真核生物の放射の開始時に存在したことを示唆した。 44/45イントロンの位置は、TALE以外のホメオボックス遺伝子に保存されていることから、最も祖先的な位置であると考えられる。 このことから、48(2/3)イントロンの獲得と44/45イントロンの消失は、44/45イントロンを持つプロトTALEが複製され、48(2/3)イントロンを持つ第2のTALEを生成するという初期の出来事を伴っていたと推測される。 48(2/3)イントロンの位置は、ViridiplantaeとMetazoaのKNOX/MEISグループ遺伝子、RhodophytaとCryptophytaのPBXグループ遺伝子に見られることから、重複したTALEは真核生物の放射化において系統特異的な異種二量体を形成するために早期に発生し多様化したと推測された。 また、TALEホメオドメインの48(2/3)イントロンの位置は真核生物の放射化において何度も獲得された可能性がある。

ヘテロ二量体のTALEが系統特異的に進化したことを踏まえ、原型TALEが複製された時の姿はどのようなものかについて検討した。 以下の観察から、プロトTALEはホモ二量化タンパク質であったことが示唆された。 まず、古細菌で同定されたPBX/GLXクラスのタンパク質のPBC-相同ドメインには、もともとMEIS/KNOX-相同ドメインと類似しているとして定義されたMEINOX-モチーフが含まれている（図3）。 また、PBX-Glauco配列はPBLドメイン内にELK-homologyを持ち（図3）、これはViridiplantaeのKNOXクラス配列のELKドメインとよく一致している（Additional file 3: Figure S15）。 したがって、ヘテロ二量化するKNOX群とPBX群に共通するMEINOXモチーフとELK相同性は、単一のTALEから重複と下位機能化によってヘテロ二量化するTALE群が生まれたことを支持した

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