The Promise of IMPROVED THERAPIES THROUGH MOLECULAR STUDIES OF FETAL HEMOGLOBIN REGULATION
The nontargeted therapeutic approaches discussed above has shown promising and some success at in clinical settings.しかし上記のような非標的治療法は、HbF誘導の臨床現場で、その有望性と成功を示している。 胎児から成人への正常なヘモグロビン交換に必要な分子基盤の理解が進めば、より効果的で特異的なHbF誘導のためのアプローチが開発されることが期待される。 グロビン遺伝子の分子クローニングから数十年の間に、グロビン遺伝子の制御に関与する様々な転写因子が同定された（Cantor and Orkin 2002）。 これには、GATA1、KLF1、SCL/TAL1などの転写因子が含まれる。 しかし、これらの因子のグロビン遺伝子制御における役割を研究することは、これらの因子の分化における幅広い役割と、グロビンおよび赤血球遺伝子制御の調節因子としての多面的な役割によって混乱させられた。 これらの因子はいずれも胎児から成人へのヘモグロビンスイッチの特異的な制御因子ではないようであった。 グロビン遺伝子の最初のクローニングから、このプロセスの特異的な制御因子が同定されるまでに30年近くかかった。 多くのグループが、標的研究およびゲノムワイド関連研究（GWAS）の両方を用いて、HbFレベルに共通する遺伝的変異の根拠を追求した（Menzelら、2007；Theinら、2007；Lettreら、2008；Udaら、2008）。 これらの研究の結果、HbF値に影響を与える共通のバリアントを保有する3つのゲノム遺伝子座が同定された。 これには、2番染色体のBCL11A遺伝子の領域、6番染色体のHBS1LとMYB遺伝子の間の遺伝子間領域、11番染色体のβ-グロビン遺伝子座の変異が含まれる。 これらの遺伝子変異をより詳細にマッピングした最近の研究によると、HbFレベルの変動の>50%は、これら3つの遺伝子座における共通の変動によって説明される可能性があることが示唆されている（Galarneau et al.2010）。 HbFレベルは約80％の範囲の遺伝的要素を持つと考えられているが、共通の遺伝的変異から見出される相加的遺伝的変動は、検出されない可能性のある高次の遺伝的相互作用を無視することを心に留めておくことが重要であり、したがってHbFレベルがどの程度遺伝的に決定されているかは、今後の研究において引き続き調査する必要がある（Zuk et al. 2012）。
亜鉛フィンガー転写因子BCL11A内のHbFレベルと関連する変異の最初の観察から、BCL11AがHbF発現の調節因子であるかもしれないという仮説を追求する最初の研究が始まった（Sankaran et al.2008）。 以前の研究では、BCL11AはBリンパ球形成と神経発生に関与する重要な転写調節因子であることが示唆されていた（Sankaran et al.2010）。 BCL11Aタンパク質レベルは、発現の発生段階と相関しているようで、γ-グロビンを高レベルで発現している原始肝臓や胎児期の確定赤血球は、BCL11Aの完全長フォームの発現が低いか、あるいはないことがわかった。 この結果は、この遺伝子産物がγ-グロビン遺伝子の抑制因子として働いていることを示唆するものであった。 このことを直接確かめるために、初代成体赤血球前駆細胞においてshort-hairpin RNA（shRNA）アプローチを用いたBCL11Aのノックダウンを行ったところ、γ-グロビンの発現が強固に誘導されることが確認された。 γ-グロビンの誘導の程度は、BCL11Aのノックダウンの程度に関連しているようであった。 興味深いことに、強固なγ-グロビン誘導が見られるにもかかわらず、赤血球生成に大きな障害は生じなかったようである。 その後の研究により、shRNAを用いてBCL11Aの発現をノックダウンしても同様の結果が得られた（Borgら、2010年、Zhouら、2010年、Wilberら、2011年）。 さらに、BCL11Aは、初代赤血球のヒトβ-グロビン遺伝子座においてクロマチンと直接相互作用し、転写因子GATA1およびNuRDクロマチンリモデリングおよびリプレッサー複合体の一部として作用するらしいことが示された（Sankaran et al.2008）。 興味深いことに、NuRD複合体はHDACs 1と2を含んでおり、これらはHbFサイレンシングに必要な重要なHDACsであることが示唆されている（Bradner et al.2010）。 また、転写因子SOX6は、BCL11Aと協力して、ヒトのγ-グロビン遺伝子のサイレンシングを助ける可能性が示唆されており、これらのグロビン遺伝子の近位プロモーターとの結合に必須である可能性がある（Xu et al.2010年）。
マウスモデルにおけるヘモグロビンのスイッチングは、ヒトβ-グロビン遺伝子座のトランスジーンを保有するものでさえ、ヒトに見られる正常なグロビン発現の個体発生から乖離しているように見えるが、BCL11Aがグロビン遺伝子のサイレンシングとスイッチングにおいて進化的に保存されている役割がマウスで示された（Sankaranら、2009; McGrathら、2011). BCL11Aを欠くマウスは、正常な赤血球形成を行うようであるが、確定的な赤血球細胞において胚性グロビン遺伝子を完全に沈黙させることができず、無傷のヒトβ-グロビン遺伝子座が存在する場合には、γ-グロビンの持続的な発現がある程度許容される。 これらの結果から、BCL11Aは哺乳類におけるグロビンスイッチングの重要なメディエーターであることが明らかになった。 この最初の研究は、マウスのグロビン切り替えの発生過程におけるBCL11Aの役割を取り上げたものであったが（Sankaran et al. 2009）、より最近の研究では、BCL11Aの条件付き不活性化を用いて、誘導性不活性化により、早い時点で不活性化した場合と同様の範囲の強固なγ-グロビン遺伝子誘導をもたらすことが示されている（Xu et al.） さらに、ヒトとマウスではグロビン遺伝子の制御に違いがあるが、BCL11Aの不活性化は鎌状赤血球病モデルマウスで見られる血液学的および病理学的特徴を改善するのに十分であることが示され、BCL11Aを標的としたHbF誘導の有効性の可能性について重要な証明となった (Xu et al. 2011)。 最近の研究では、これは、近位のγ-グロビンプロモーターでクロマチンと結合するSOX6などの転写因子との相互作用と、β-グロビン遺伝子群全体の様々な領域との長距離相互作用の両方を介して行われる可能性が示唆されている（Xu et al.2010）。 BCL11Aが欠損すると、β-グロビン遺伝子座の構造が変化し、遺伝子座制御領域と呼ばれる上流のエンハンサーが転写活性化されたγ-グロビン遺伝子と並置された状態になる。 同様の現象は、γ-グロビン遺伝子の発現を誘導するHDAC阻害剤で細胞を処理した場合にも起こる（Bradner et al.2010）。 しかし、これらの構造変化がBCL11Aによって直接的に媒介されるのか、あるいはBCL11A（またはHDAC）阻害によるHbF誘導効果によって二次的に起こるのかは不明である。 しかしながら、これらの知見は、BCL11Aがβ-グロビン遺伝子座におけるγ-グロビンの発現を抑制する直接的な役割を担っているようだという考えを強く支持するものである。 HbFが適度に増加し、グロビン鎖の不均衡がある程度残るδβ-サラセミア、あるいはグロビン鎖の合成がバランスよく増加するHPFHとなるヒトβ-グロビン遺伝子座内の様々な欠失をマッピングすることにより、δグロビン遺伝子上流のN3kb領域が、γ-グロビン遺伝子を抑制するのに必要であることが示された（図2）（Sankaran et al.2011年c）。 興味深いことに、この領域はBCL11AとそのパートナーであるGATA1やHDAC1との結合部位を有している。 また、この領域は、ヒトのコルフサラセミア欠失の研究を通じて、γ-グロビンのサイレンシングに重要であることが独立して示唆されている（Chakalova et al.2005）。 この研究は、BCL11AがHbFを沈黙させるためにどのように機能するかについての重要な機構的洞察を提供し、ヒトに特有のこの発生プロセス（図2）を理解するためのヒト天然突然変異の重要性を強化する（Sankaran et al.2011）（6941>
ヒトβ-グロビン遺伝子座におけるγ-グロビンサイレンスの制御に関するモデル。 この図は、図1に示すようなヒトβ-グロビン遺伝子座を、様々な遺伝性persistence of fetal hemoglobin（HPFH）欠失で除去される領域とδβ-サラセミア欠失で除去される領域とを比較して見出したδ-グロビン遺伝子上流の〜3kb領域で描いた（Sankaran et al.2011c）ものである。 典型的な欠失は、遺伝子座の下のモデルに示されている。 さらに、Corfuサラセミア欠失も、下のモデルで示すように、この領域が削除されることが知られている。 BCL11Aは、パートナーのGATA1およびHDAC1とともに、この3kb領域内のクロマチンに結合することが示されている（Sankaran et al.2011c）。 BCL11AはBリンパ球など他の細胞系にも重要な影響を及ぼすことが知られているが、その不活性化が赤血球造血に大きな障害をもたらすことなくHbFを誘導するという事実は非常に有望であり、HbF誘導のためのBCL11Aの標的化を進める取り組みの一環として、in vivoモデル化と分析の重要性を強調している。 BCL11Aが機能する作用機序を探るさらなる研究が、HbF誘導のためのより良い、より特異的な標的アプローチにつながる可能性がある（Sankaran et al.2011c）。 SOX6もまた、正常な赤血球生成に必要であることが知られているが（Dumitriuら、2006）、HbF誘導の有望なターゲットとなる可能性がある（Xuら、2010）。 しかし、SOX6がヘテロ接合で破壊されてもHbF値が上昇しない患者が報告されていることから、SOX6遺伝子には投与量補償のメカニズムがあるか、あるいはこの遺伝子の発現を低下させてもHbF誘導がしっかり行われる特定の閾値が存在する可能性がある（Sankaranら 2011a）。 このことは、SOX6をHbF誘導の標的として考えることには限界があることを示唆している。
BCL11Aに関する最初の研究に続き、二つの研究が、独立した補完的なアプローチでBCL11Aの発現が赤血球特異的転写因子KLF1により制御されているらしいことを示唆した。 1つの研究では、KLF1のhypomorphic alleleを持つマウスは胚性グロビンの発現を上昇させ、ヒトβ-グロビン遺伝子座を持つトランスジェニックマウスはγ-グロビンの持続的発現を示した（Zhou et al.2010）。 そこで研究者らは、ヒトの初代赤血球でも同様の制御が行われるかどうかを検証し、shRNAのアプローチで同様の関連を示すことができた。 そして、この効果は、β-グロビン遺伝子座におけるKLF1の直接的な作用と、KLF1ノックダウンによるBCL11Aの発現低下を介した間接的な作用の両方によって生じることを明らかにした。 この発見は、KLF1がBCL11A発現の直接的な正の転写調節因子であることを示すものであった。 もう1つのグループは、この家系のKLF1ミスセンス変異に起因することが示唆されたHPFHの非連結型の遺伝的基盤について調べた（Borg et al.2010）。 この研究者らは、これらの患者および発症していない対照者の初代細胞を用いて、見られる効果は、BCL11Aに対するKLF1のサイレンシング効果に一部起因するものであることを示すことができた。 現在も不明な点の1つは、KLF1変異の様々な症例で見られるヒトの表現型に関するものである。 最初の報告では、ミスセンス突然変異のすべてのレシピエントにHbF発現の上昇が見られたが、実際にはヘモグロビン総量の3％から19％の間で変動していることに注意すべきである。 さらに、ヒトにおけるヘテロ接合性KLF1突然変異の他の報告では、赤血球造血の同時破壊を示すか、HbF発現にほとんど影響を示さない（Arnaudら、2010年；Sattaら、2011年）。 より最近の研究では、KLF1の稀な変異は確かにHbFの上昇と関連しているが、同様の変異であっても一貫して同じ程度に発生するわけではないらしい（Gallienneら、2012）。 このような変異の根拠はまだ解明されておらず、KLF1が直接的にも間接的にもHbFの発現に影響を与えるメカニズムをよりよく理解することが重要であろう。 このことは、HbF誘導のためにKLF1を標的とすることを試みる今後の研究にとって、特に赤血球分化に対するそのような阻害の有害な影響を回避するためには、極めて重要であろう。 しかし、赤血球系におけるKLF1の特異性を考えると、また、KLF1のグロビン遺伝子調節活性を特異的に標的とすることができれば、やはりHbFを誘導する候補として考えるべきであろう。
ヒトのHbFレベルに関連するBCL11Aで同定された共通の遺伝子変異に加えて、GWAS研究は、ヒトのHbFレベルに劇的な影響を与えると思われる遺伝子HBS1LとMYBの間の遺伝子間の第6染色体の変異があることを示した (Menzel et al. 2007; Thein et al. 2007; Lettre et al. 2008; Uda et al. 2008). この遺伝子座の遺伝子変異は、BCL11A遺伝子座の遺伝子変異と同様に、あるいはそれ以上にβ-ヘモグロビン異常症の臨床的罹患に影響を及ぼすと考えられるため、これらの変異がHbFレベルの変化をもたらす作用機序の解明は重要である（Galanelloら、2009；Nuinoonら、2010）。 興味深いことに、この領域には、赤血球前駆細胞におけるMYBの発現を制御する上で重要な役割を持つことが示唆されている様々な制御要素が含まれている（Mukai et al.2006; Wahlberg et al.2009; Stadhouders et al.2011 ）。 HBS1Lの過剰発現は、K562赤血球白血病細胞におけるγ-グロビン発現に影響を与えないように見えたが、MYBの過剰発現は、これらの細胞において産生されるγ-グロビンのレベルに影響を与えるように見えた（Jiang et al.、2006）。 さらに、HbFの発現が高いヒトの初代赤血球前駆細胞の培養物では、MYBの発現が低下していることが多かった（Jiang et al. 13番染色体の部分トリソミーの患者に見られるHbFの上昇に必要であると示唆された13番染色体上の領域の遺伝子をファインマッピングし、統合ゲノム解析を行ったところ、このような活性を担う最有力候補として、マイクロRNA15aおよび16-1の2つの小さな約22塩基RNA分子があることがわかった（Sankaran et al.2011b)。 これらのマイクロRNAを培養中の初代成体赤血球で過剰発現させると、γ-グロビンの産生量が増加した。 これらのマイクロRNAの標的を検討したところ、赤血球細胞における主要な標的の1つがMYBであることがわかった。 成体の初代赤血球前駆細胞でMYBを直接ノックダウンすると、γ-グロビン産生が劇的に増加し（Sankaran et al. 2011b）、稀なヒト異数性症候群からのこの歴史的観察が、HbFレベルを調節する分子メカニズムを調べるより最近の研究へとつながりました
MYB による HbF レベルの調節メカニズムは、まだ不明です。 これは、赤血球生成の動態に影響を与えるためかもしれないし、あるいは、β-グロビン遺伝子座における直接作用の結果として起こるかもしれない（Higgs and Wood 2008）。 このようなメカニズムを解明するためには、さらなる研究が必要であり、HbF誘導のためにこの分子を治療標的とする試みには、大きな期待が寄せられている。 MYBの標的化は、特に造血におけるMYBの多面的な役割を考えると、望ましくない副作用をもたらす可能性が懸念される（Emambokusら、2003；Carpinelliら、2004）。 しかし、最近の研究では、このような戦略が実際に有望であることが示唆されている。マウスのMYBを部分的にノックダウンしても、白血病の進行を劇的に阻止する一方で、in vivoでの正常な造血にはほとんど影響がなかったからだ（Zuber et al.2011a）。 したがって、MYBの部分的な阻害は、HbF誘導のための貴重な戦略として有望であると考えられる。 HBS1L-MYB遺伝子間領域の変異体とBCL11A遺伝子座の変異体の効果の相加性（Lettreら2008；Galanelloら2009；Nuinoonら2010）は、これらの経路の両方を一緒に標的とすることで、いずれかの経路だけを標的とするよりさらに強力な効果が得られることを示唆している。
上述したHbF調節の調節因子は、ヒトの遺伝子研究を通じて見出され、したがって、ヒトにおける生体内での関連性が確認されているが、細胞培養アプローチまたはマウスモデルを用いた様々な研究を通じて、他の様々な分子もγ-グロビン遺伝子調節において役割を果たすことが示唆されている（表1）。 これらの分子については後述する。 現在、γ-グロビン遺伝子制御の研究に用いられている実験系の多くには限界があることを心に留めておくことが重要である。 ヒトの初代赤血球は、γ-グロビン産生を増加させるような操作に対して寛容であるように思われるが、これは必ずしもin vivoのヒトに関連したものではないかもしれない。 さらに、様々な種類のストレス赤血球生成やヒドロキシ尿素による治療など、ヒトの生体内でγ-グロビン生成を誘導することが知られている刺激の多くは、ヒト化マウスモデルでγ-グロビン生成を誘導する機能はない（Paceら1994；Sankaranら2009）ため、この実験系での否定的知見の解釈には重要な限界があると強調されている。 したがって、ヒトの遺伝学的研究、あるいはヒトや霊長類の生体内で行われた研究からの証拠によって裏付けられていない実験結果を解釈する際には、注意が必要である。
A partial list of fetal hemoglobin regulators
| Regulator | HbF を増やすために必要な調節の方向 | Human genetic HbF調節における役割を支持する証拠 | HbF調節に関与する因子を調節するヒトまたは霊長類の研究 | HbF調節における役割を支持する細胞培養データ | Evidence HbF制御の役割を示唆するマウスモデルから |
|---|---|---|---|---|---|
| BCL11A | ↓ | × | × | ||
| KLF1 | ×↓ | × | × | ||
| MYB | ↓ | × | × | ||
| MicroRNA 15a/16- | × | × | × | × | |
| sox6 | ↓ | × | |||
| HDACs 1/2 | ↓ | × | × | × | |
| dnmt1 | ↓ | × | × | × | |
| TR2/TR4 | ↓ または | × | |||
| COUP-> | ↓ | × | |||
| fop | ↓ | × | |||
| nf-E4 | × |
γ- グロビン遺伝子プロモーター内に見られる直接反復要素と結合するタンパク質を調べることによって。 オーファン核ホルモン受容体TR2およびTR4は、γ-グロビン遺伝子の発現を抑制する役割を果たすことが示唆されている（Tanabe et al. 2002, 2007; Cui et al. 2011）。 逆説的ではあるが、TR2およびTR4をトランスジェニックマウスモデルで過剰発現させると、γ-グロビンの発現が上昇し、鎌状赤血球病マウスモデルで過剰発現させると、これらのマウスの血液学的および病理的症状が一部改善される（Campbell et al.2011）。 TR2およびTR4について、これらの観察の基礎となるメカニズムおよびヒトのグロビン遺伝子制御との関連は、まだ確立されていない。 さらに、オーファン核ホルモン核内受容体COUP-TFIIも、ヒトではダイレクトリピートに結合し、γ-グロビンプロモーターを抑制することが示唆されている（Filipe et al.1999）。 成体初代赤血球のin vitro培養を用いて、SCFなどのサイトカインがβ-グロビン遺伝子座におけるCOUP-TFIIの発現およびクロマチン占有率を低下させ、結果としてγ-グロビンの発現が増加するらしいことが明らかになった（Aerbajinai et al.2009）。 さらに、低分子干渉RNA（siRNA）を用いてCOUP-TFIIを直接ダウンレギュレートすると、γ-グロビン産生が増加する可能性がある（Aerbajinai et al.2009）。 HbFの制御におけるCOUP-TFの役割に関するさらなる研究が、ヒトにおけるその生理的役割をよりよく理解するために必要となるであろう。
最近の研究では、PRMT1の友人（FOP1）と名付けられた遺伝子が、γ-グロビン遺伝子発現抑制に関与することも示唆されている（van Dijk et al.、2010年）。 FOP1をノックダウンすると、培養中のヒト成人赤血球細胞でHbFの発現が上昇する。 これは、SOX6のノックダウンが、γ-グロビン産生の増加をもたらすことが知られているSOX6の発現低下を介していることが示唆された（Xuら、2010年）。 これらの知見を確認し、この遺伝子がより広範に赤血球生成に関与しているかどうかを理解し、これらの観察の基礎となるメカニズムを調べるために、さらなる研究が必要である。
いくつかの研究では、ヒトにおけるγ-グロビン発現の活性化因子としてステージセレクタタンパク質NF-E4の役割も示唆している (Jane et al. 1995; Zhao et al. 2006). また、NF-E4の短縮型が、γ-グロビン遺伝子のプロモーターにおけるNF-E4の正常な活性化機能を阻害することにより、γ-グロビン遺伝子を抑制する役割を持つ可能性が示唆されている（Zhou et al.2004）。 これらの研究はすべて培養細胞で行われた実験とK562細胞からのタンパク質複合体の生化学的精製に基づいているため、γ-グロビン発現におけるこの遺伝子の生理的役割を確認し、この複合体がヒトグロビン遺伝子制御を変えるために作用している可能性のあるメカニズムをよりよく理解するためにはさらなる研究が必要となるであろう
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