Restriction-modification
Restriction-modification (RM) システムは原核生物界に普遍的に存在し、外来DNAに対する防御システムとして働いている。 現在、47のタイプI、3320のタイプII、8つのタイプIIIのシステムが知られている。 R. Roberts (Beverly, MA) は、最近まで、制限酵素は、培養コレクションや環境試料からバクテリアを入手し、制限活性を分析することによって同定されてきたと指摘した。 現在では、DNAメチルトランスフェラーゼ（MTase）遺伝子の保存されたモチーフによって同定できる新しいDNA配列をスクリーニングし、関連遺伝子を探すことが可能である。 DNAメチル基転移酵素と制限酵素の遺伝子は連鎖していることが多いので、これらは制限酵素遺伝子の良い候補となる。 最近のゲノムプロジェクトでは、この方法で予想外に多くの推定型制限酵素系が同定されている。 例えば、Helicobacter pyloriゲノムでは、25種類のMTase遺伝子が同定され、そのうちのいくつかは制限酵素遺伝子と関連していた。 したがって、データベースのスクリーニングは、新しい特異性を持つ制限酵素を見つけるための非常に生産的な方法となる可能性がある。 A. Piekarowicz（ポーランド、ワルシャワ）は、新しいタイプのIC制限酵素、NgoAXVIの同定につながったこのようなアプローチの一例について報告した。
タイプIおよびタイプIII制限酵素、ならびにメチル依存性McrBC酵素は、2つの認識部位を必要とし、DNA切断にATP（McrBC：GTP）の加水分解に依存している（Rao他、2000にレビューあり）。 切断は、2つのそのような酵素がDNAを移送中に衝突したときに起こるので、2つの部位が必要であることを説明している（図（Figure2）.2）。 T. Bickle（スイス、バーゼル）は、タイプI酵素とMcrBCも、非特異的ブロックにぶつかると、DNAを切断するように刺激されることを実証した。 一方、III型酵素はこのようなブロックによって阻害される。なぜなら、それぞれの転座酵素は一方の鎖のみを切断し、両方のDNA鎖を切断するためには別の酵素の協力が必要だからである
Fig. DNA切断にATP（またはGTP）を必要とする制限酵素の活性化モデル。 線状DNA分子上の2つの認識部位に2つの酵素分子（または複合体）が結合した後、DNAは、システムによってATPまたはGTPを必要とする、活性でエネルギー依存的なプロセスで移動する。 これにより、DNAはループ状になる。 切断は2つの移動する複合体が衝突した後、認識部位の近傍（III型酵素とMcrBC）またはそれ以上離れた部位（I型酵素）でランダムに起こる
ほとんどのII型制限酵素は回文状の認識部位の1コピーと作用するホモダイマーだが、2部位で協調する必要があるサブタイプが存在する（Pingoud and Jeltsch, 1997にレビューあり）。 S. Halford (Bristol, UK)が指摘するように、これはNaeIのようなIIe型酵素だけでなく、SfiIのようなIIf型酵素やFokIのようなIIS型酵素でも同様である。 IIf型酵素は、2つのサブユニットによって形成される2つの別々のDNA結合部位を持つホモテトラマーである。 SfiIは両方のDNA結合部位を占めたときのみ活性化し、両部位が同時に切断される。 FokIは切断ドメインと認識ドメインからなり、切断が起こるためにはDNA上で酵素が二量体化することが必要であることが以前示された。 今回Halfordは、それぞれの認識ドメインが認識配列と相互作用する必要があるため、効率的な切断のためには2つの認識部位が必要であることを明らかにした。 3種類の酵素はすべて、同じDNA上の2つの部位で最適に作用し、部位間のDNAをループ状に捕捉する。 BbvCIは非対称な配列を認識するヘテロ二量体型の制限酵素である。 サブユニットは個々には不活性であるが、一緒になると活性化する。 このため、G. Wilson (Beverly, MA)が報告したように、部位特異的変異導入法を用いて一方のサブユニットを不活性化することにより、特異的なニッキング酵素を作り出すことができる。 A. Janulaitis (Vilnius, Lithuania) は、ヘテロ二量体の Bpu10I 制限酵素について同様の結果を得ました。 また、単一標的認識ドメインを持つ単量体制限・修飾酵素Eco57Iの基質特異性を緩和することに成功した。 この研究では、ランダム変異導入により、正規のCTGAAG部位だけでなく、CTGGAG部位とも相互作用する変異体を作製した。 この緩和された特異性の分子的基盤は、まだ解明されていない。 V. Siksnys (Vilnius, Lithuania) は、切断に二価の金属イオンに依存しない新しいタイプIIs制限酵素、BfiIを発見したと報告した。 この酵素はSalmonella typhimuriumの非特異的ヌクレアーゼと配列が類似しており、おそらく同様の触媒機構を利用しているものと思われる。 Pingoud（ドイツ、Giessen）は、共通の機能を持ちながら、一般に異なる構造を持ち、異なる切断機構をたどることが推定されるII型制限酵素とホーミングエンドヌクレアーゼによるDNA切断の機構を議論した。 触媒モチーフを共有する多くの制限酵素について詳細な構造情報が得られているにもかかわらず、触媒機構や触媒に関与するMg2+イオンの数については、コンセンサスが得られていない。 原理的には、制限酵素様の触媒中心を持つ他のリン酸転移酵素についても同様である。 そのようなタンパク質の例として、Vsr修復酵素（大腸菌）やHjcレゾルバーゼ（Pyrococcus furiosus）などがある。 後者の結晶構造は、森川紘一氏（日本、大阪）により発表された（図（Figure3）.3）。 一方、HNHファミリーのホーミングエンドヌクレアーゼ、例えばI-PpoIによるDNA切断のメカニズムは、この酵素と「ββα-Me finger」スーパーファミリーの関連酵素の詳細な生化学情報に加え、遊離酵素、酵素-基質および酵素-生成物の複合体の構造情報が得られているので、より確立されていると思われる。 これらの酵素は、保存されたAsnに結合するMg2+イオンを補因子として必要とする。 攻撃側の水酸基は保存されたHisによって生成され、遷移状態の安定化には保存されたArgが関与し、脱離基のプロトン化はMg2+イオンの水和球からの水分子によって行われる。 HjcとVsrの制限酵素フォールドの比較は、関連機能を持つ酵素の構造保存の一例である。 HjcとVsrのリボン図は、2つの構造を重ね合わせた後、同じ向きで示している。 活性部位残基の側鎖は強調表示され、保存されている2つのAsp残基はラベル付けされている。 この図は、西野哲也氏、森川紘一氏のご好意によりご提供いただきました。
細菌はバクテリオファージと戦うためにRMシステムを開発しました。 その結果、バクテリオファージは細菌のRMシステムによる制限から逃れるための様々な手段を開発した。 D. Dryden (Edinburgh, UK) は、バクテリオファージT7の遺伝子0.3タンパク質がI型制限修飾酵素を阻害することを生化学的に分析した結果を報告した。 このタンパク質は制限酵素と化学量論的に結合し、その伸長した形と表面負電荷のために、おそらく酵素のDNA結合部位を完全に埋め、それによってDNA結合を阻止する。
RMシステムは制限酵素とDNAメチルトランスフェラーゼ（MTase）（チェング、1995；ロバートソンとウォルフ、2000でレビュー）から構成されている。 しかし、DNAのメチル化パターンはDNAに情報を付加し、それによってそのコード能力を拡張するため、MTaseはRMシステムにおける制限酵素の仲間であるだけでなく、他の多くの重要な機能を有している。 原核生物では、DNAの修復、遺伝子発現やDNA複製の調節に関与している。 真核生物では、DNAメチル化は一般に遺伝子の転写抑制につながる。 また、X染色体の不活性化、インプリンティング、遺伝子制御などのエピジェネティックな過程にも寄与している。 マウスの発生にいくつかのDNA MTaseが必須であることが発見され、DNAメチル化の重要性が広く認識されるようになった
X. Cheng（ジョージア州アトランタ）は、真核生物のDNA MTaseの最初の構造となる可能性のあるDnmt2タンパク質の構造を発表した。 このタンパク質はMTaseフォールドを持ち、特徴的な触媒モチーフをすべて持っているが、触媒活性はないようである。 このことから、このタンパク質は本当に酵素なのか、また、その基質は何なのか（DNA、RNA、その他）、といった疑問が出てきた。 ChengとA. Jeltsch（ドイツ、ギーセン）による真核生物の酵素に関するさらなる議論では、Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3bの酵素が扱われた。 両氏は、これらの巨大酵素（最大1700アミノ酸残基からなる）の切断タンパク質や単離ドメインで得られた結果を報告し、精製酵素の酵素学的解析に関する結果も発表した。 Dnmt1の触媒ドメイン（約500アミノ酸残基）は単離された状態では活性を持たないため、酵素の他の部分と密接に制御されているはずである。 この相互作用は、ヘミメチル化DNAに対する高い特異性を確保するために必要なのかもしれない。 この分野の進歩にもかかわらず、真核生物におけるDNAメチル化の過程、特にDNAメチル化のパターンを作り出すメカニズムはまだ十分に解明されていません。
原核生物におけるDNAメチル化については、ある程度知られています。 原核生物のM.RsrI MTaseの構造を発表し、すべてのMTaseの触媒ドメインが共通の構造を持っているという推測を確認した。 S. Klimasauskas (Vilnius, Lithuania), D.N. Rao (Bangalore, India), Gumport and Jeltschは、4つの原核生物MTase (M.HhaI, M.EcoP15, M.RsrI and M.EcoRV) の分子酵素学について論じました。 これらの酵素の触媒サイクルは、DNAと補酵素の結合、標的部位の位置と認識、塩基反転やメチル基転移を含む複合体の構造変化を伴う（図（Figure4）.4）。 また、基質と補酵素の結合順序や律速段階が異なるなど、細部の違いも明らかになった。 2-アミノプリンは、塩基反転など、MTaseと複合体化したDNAが受ける構造変化のキネティクスを解析するのに適したツールであることがわかった。
Fig.4. 制限酵素とDNAメチルトランスフェラーゼによる標的部位の位置決めのメカニズム。 まずDNAが非特異的に結合し、次にDNA上での拡散促進（スライド、ホッピング）により標的部位が位置決めされる。 標的部位への接触は、酵素とDNAの構造変化を引き起こし、それが触媒作用の引き金となる。 このメカニズムは、DNAと特異的に相互作用するほとんどの酵素に共通するものである
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