La colocalización de alta resolución de una sola molécula de Cy3 y Cy5 unida a macromoléculas mide las distancias intramoleculares a través del tiempo

Materiales y métodos

Preparación del ADN dúplex. Para hacer las moléculas de ADN dúplex de 30 pb, se hibridaron dos oligonucleótidos con la siguiente secuencia y modificaciones (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). El oligonucleótido 5′-GGGTATGGAGATTTAGCGAGTGACAGC-3′ se marcó con Cy5 en su extremo 5′ y con Cy3 en su extremo 3′. El oligonucleótido complementario se marcó con biotina en ambos extremos.

Expresión y purificación de la proteína. El gen de la proteína amarilla fluorescente (YFP) en el plásmido p2Bac/pFastBac-YFP-M5-CaM (un regalo de H. Lee Sweeney, Universidad de Pensilvania, Filadelfia) se eliminó mediante PCR. El plásmido p2Bac/pFastBac-M5-CaM resultante codifica la miosina V de pollo truncada en Glu-1099. Una cremallera de leucina sigue a la espiral nativa para asegurar la dimerización. Para facilitar la purificación, la proteína miosina V fue marcada N-terminalmente con una etiqueta FLAG (DYKDDDDK). Se generaron dos baculovirus recombinantes para la expresión de la proteína en células Sf9. Uno codificaba la miosina V truncada y la calmodulina de Drosophila melanogaster derivada del plásmido p2Bac/pFastBac-M5-CaM. El segundo virus codificaba la cadena ligera esencial humana derivada del plásmido p2Bac/pFastBac-ELC. Ambos virus se utilizaron para la coinfección de células Sf9. La proteína se expresó y purificó según lo descrito por Sweeney et al. (20).

Etiquetado e intercambio de calmodulina. La calmodulina se expresó y se marcó con Cy3 o Cy5 de la siguiente manera: Se introdujo una única cisteína en la calmodulina de erizo de mar mediante la mutación Q143C. Esta calmodulina se expresó en Escherichia coli y se purificó como se describe en la ref. 21. La calmodulina se marcó con soluciones madre de Cy3-maleimida o Cy5-maleimida (Amersham Biosciences) (en DMSO) a una proporción molar de 1,4 veces durante 20 min. El exceso de colorante se eliminó por filtración en gel en tampón de intercambio (abajo), seguido de una absorción hidrofóbica durante la noche en BioBeads (Bio-Rad). La incorporación de la etiqueta fue del 102% para la Cy3-calmodulina y del 75% para la Cy5-calmodulina. Las alícuotas se almacenaron a -80°C.

El intercambio de calmodulina marcada en la miosina V se realizó como se describe pero con algunas modificaciones (22). La miosina V (150 nM) se incubó con 0,7 nM de calmodulina marcada con Cy3 y 0,8 nM de calmodulina marcada con Cy5 en el tampón de intercambio (25 mM KCl/20 mM imidazol HCl, pH 7,4/2 mM MgCl2/1 mM EGTA) a 22°C durante 2 min. Para el intercambio de calmodulinas, se añadió 0,9 mM CaCl2 y la mezcla se incubó a 22°C durante 5 min. La reacción se apagó con 7 mM de EGTA. La mezcla de reacción se aplicó en un dispositivo de ultrafiltración Nanocep de 100K MWCO (Pall) y se lavó tres veces con volúmenes iguales de AB (abajo) para purificar la miosina V del exceso de calmodulina.

Preparación de la celda de flujo. La celda de flujo se construyó con un portaobjetos de vidrio y cubreobjetos altamente refractantes hechos de NLAF21 (VA Optical Labs, San Anselmo, CA) mantenidos juntos por trozos de cinta Scotch de doble cara.

Para los experimentos con miosina V, se incubaron 15 μl de biotina-BSA (1 mg-ml-1) en la celda de flujo durante 2 min, tras lo cual se pasaron 30 μl de tampón AB (25 mM KCl/25 mM imidazol HCl, pH 7,4/1 mM EGTA/4 mM MgCl2/10 mM DTT/1 mg-ml-1 BSA) a través de la celda de flujo para lavarla. Se añadieron 15 microlitros de NeutrAvidina 0,5 mg/ml (Molecular Probes) a la célula y se dejó incubar durante 2 minutos, tras lo cual se realizó otro lavado con tampón AB. La célula de flujo se incubó con 15 μl de filamentos de actina de faloidina biotinilada (250 nM) durante 5 min, seguido de un lavado de 100 μl con tampón AB. Por último, la célula se cargó con 20 μl de tampón de imagen que incluía miosina V intercambiada por calmodulina, 5 μM de calmodulina, 300 nM de ATP, un sistema de regeneración de ATP (0,1 mg-ml-1 de creatina fosfocinasa/1 mM de creatina fosfato) y 0,5% (vol/vol) de Triton-X 100 para reducir la unión inespecífica. La célula se selló con grasa al vacío y se obtuvieron imágenes inmediatamente. La concentración final del motor dio como resultado una actina escasamente decorada y, por lo tanto, permitió un análisis de moléculas individuales de miosina V.

Para los experimentos de ADN, la biotina-BSA y la NeutrAvidina se cargaron de la misma manera que para los experimentos de miosina V, pero los lavados se realizaron con el tampón T50 (10 mM Tris, pH 8,0/50 mM NaCl). Una vez que la celda de flujo tenía un recubrimiento de NeutrAvidina, se introdujeron 15 μlof de dsDNA (30 nM) en tampón T50 con 1 mg-ml-1 de BSA y se incubaron durante 2 minutos, tras lo cual se introdujeron 100 μl de tampón de imagen. A continuación, se selló la celda de flujo con grasa de vacío y se obtuvieron rápidamente imágenes. La decoración resultante de las moléculas de ADN en la superficie era lo suficientemente escasa como para que los puntos fluorescentes de diferentes moléculas rara vez se superpusieran.

Configuración del microscopio. El microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) se configuró como se describe en la ref. 8, con algunas modificaciones (Fig. 5, que se publica como información de apoyo en el sitio web de PNAS). Los haces de la fuente de excitación a 532 nm (Coherent, Santa Clara, CA) y 633 nm (JDS Uniphase, San Jose, CA) se combinaron mediante un espejo dicroico y se expandieron a un diámetro de 7 mm. Estas fuentes se enfocaron (longitud focal = 500 mm) en el plano focal posterior de un objetivo TIRF Olympus de 1,65 NA ×100 mediante un dicroico de línea láser en una traslación lineal DeepL que permite el funcionamiento del microscopio en los modos de epifluorescencia o TIRF. El objetivo se colocó bajo una traslación piezoeléctrica de dos ejes de bucle cerrado equipada con sensores capacitivos para la medición de la posición (Physik Instrumente, Auburn, MA). La luz reflejada que salía de la apertura posterior del objetivo se dirigía a un fotodiodo cuadrante para proporcionar una señal para un bucle de retroalimentación de enfoque que sujetaba la distancia entre el objetivo y la muestra con un actuador electrostrictivo (Newport, Fountain Valley, CA). El objetivo recogió la emisión de fluorescencia, que pasó a través de dos filtros de hendidura de película fina StopLine (Semrock, Rochester, NY), uno para cada fuente de excitación, y se transmitió a través de un aparato de doble vista que permitía la obtención simultánea de imágenes de los canales Cy3 y Cy5 en una única cámara EMCCD iXon DV 887 (Andor Technology, Belfast, Irlanda). Todos los datos se obtuvieron con un tiempo de integración de 0,5 segundos. La diafonía entre los dos canales (10%) presumiblemente sesga las mediciones de distancia hacia valores menores. Sin embargo, nuestro error experimental lo hace indetectable, como muestran las simulaciones de Monte Carlo en las que se crearon 100 pares de imágenes modeladas de fluoróforos individuales separados por 10 nm y se analizaron de forma idéntica a los datos de ADN (descritos a continuación). Las imágenes simuladas de funciones de dispersión de puntos fluorescentes se calcularon generando una distribución de intensidad gaussiana 2D integrada con un fondo constante al que se añadió ruido de disparo. Los picos simulados tenían las mismas dimensiones y relación señal-ruido que los picos reales. Los datos simulados con un 10% de diafonía y los datos simulados sin diafonía son indistinguibles mediante una prueba de Kolmogorov-Smirnov (N 1 = 100, N 2 = 100, p > 0,05).

Análisis de datos. Se realizó un mapa de registro de los canales Cy3 y Cy5 con fiduciales consistentes en perlas TransFluoSphere de 100 nm (Molecular Probes). Se excitaron a 532 nm y emiten con un amplio espectro de emisión. La perla era detectable en ambos canales. Localizamos una sola perla asociada al cubreobjetos, y con nuestra platina piezoeléctrica la pisamos con precisión nanométrica en un patrón de rejilla (con un espaciado de 0,5 μm), tomando una imagen en cada parada. El resultado final fue una pila de 312 imágenes que muestra la perla en ambos canales en diferentes posiciones (Fig. 1a ).