Pathogenesis In Vitro
Columnar epithelial cells zijn doodlopende cellen die twee uitersten van pH tegelijk ervaren. Apicaal baden zij in sterk alkalisch darmvocht en basaal baden zij in licht zure hemolymfe. Deze omstandigheden zijn moeilijk na te bootsen in celkweek, een feit dat de schaarste aan beschikbare informatie over primaire infectie kan verklaren.
Cellijnen die GV replicatie ondersteunen zijn zeldzaam en bestaan momenteel alleen voor CpGV. Bijgevolg weten we weinig meer over de mechanismen van GV-infectie dan over ODV-infectie. Toch weten we dat tijdens de morfogenese van de nucleocapside van GV, de kernmembraan van de gastheercel uiteenvalt, een gebeurtenis die de nucleocapsideverwerking niet verstoort. Het verdwijnen van de kernmembraan is kenmerkend en komt niet voor in NPV-geïnfecteerde gastheercellen.
Er zijn een aantal insectencellijnen vastgesteld die NPV-infecties ondersteunen. De meeste cellijnen zijn afkomstig van eierstokken of embryo’s van rupsen. AcMNPV kan zich vermenigvuldigen in cellijnen afkomstig van verschillende insectensoorten, een feit dat ertoe bijdraagt dat het het best bestudeerde baculovirus is. In een standaard eenstaps-groeicurve worden AcMNPV BV’s typisch geproduceerd 12-20 h na infectie (hpi), en occlusies, 20-48 hpi. De replicatie van de meeste andere NPV’s in celkweek duurt uren tot dagen langer.
AcMNPV BV is 1000-voudig besmettelijker dan ODV, voornamelijk door de aanwezigheid van zijn fusie-eiwit, GP64. BVs komen hun doelcellen binnen door clathrin-gemedieerde endocytose. De nucleocapsiden van BV’s dringen diep door in het cytoplasma van doelcellen doordat ze vrijkomen uit endosomen. Met behulp van deze strategie omzeilen nucleocapsiden de mogelijk gevaarlijke omgeving die vlak onder het plasmamembraan ligt en dringen zij de cel dichter bij de kern binnen dan fusie aan het plasmamembraan mogelijk zou maken. De pH-gevoelige conformatieverschuivingen die de BV fusie-eiwitten ondergaan, dienen om een fusiegebeurtenis tussen de virale omhulling en de endosomale membraan op gang te brengen.
AcMNPV’s ontsnapping uit het endosoom wordt onmiddellijk gevolgd door de associatie met F-actinekabels. Kabelvorming is van voorbijgaande aard en vindt plaats gedurende de tijd dat virale nucleocapsiden zich verplaatsen naar en binnendringen in de kern. Tijdens het transport co-lokaliseren virale nucleocapsiden met één uiteinde van een actinekabel, mogelijk via P78/83, een F-actine-bindend eiwit waarvan gedacht wordt dat het zich aan de basis van nucleocapsiden bevindt. De associatie van nucleocapsiden met F-actinekabels en de vertraging van reportergenexpressie in aanwezigheid van geneesmiddelen die de actine/myosinefunctie verstoren, suggereren dat de kabels het transport van nucleocapsiden naar de kern kunnen vergemakkelijken, of hun passage door nucleaire poriën kunnen bemiddelen.
NPV en sommige GV nucleocapsiden komen de kernen binnen via nucleaire poriën. Sommige GV’s ontcoaten bij de nucleaire poriën, maar de meeste baculovirussen ontcoaten binnen de kern. Vroege gen-transcriptie begint onmiddellijk, gemedieerd door gastheer RNA polymerase II (Pol II). Onder de vroege genen die tot expressie komen is een subset waarvan de expressie leidt tot efficiënt G-actine transport naar en accumulatie in de kern (Figuur 5). Deze spectaculaire manipulatie van actinelokalisatie is van cruciaal belang voor de productie van NPV-gen en is voor geen enkel ander pathogeen beschreven. De genen die betrokken zijn bij de nucleaire lokalisatie van actine, geïdentificeerd in transiënte transfectie-experimenten, omvatten ie1, pe38, Ac004, Ac152, he65, en Ac102. Twee van de genen, ie1 en Ac102, zijn geconserveerd onder alle lepidoptera NPV’s en GV’s, en beide zijn essentieel.
Figuur 5. Nucleaire G-actine in AcMNPV-geïnfecteerde cellen. (a) 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI)-gekleurde geïnfecteerde cellen; (b) geïnfecteerde cel die getransfecteerd groen fluorescerend eiwit (GFP)-actine uitdrukt. (c) Het ontbreken van nucleaire rhodamine-falloïdinekleuring geeft aan dat de nucleaire actine monomeer is.
De overgang naar het late stadium van infectie is het begin van de BV-progenieperiode; cellulaire activiteiten zijn gericht op maximale synthese van virale componenten, assemblage tot nucleocapsideproducten en export daarvan. De synthese van macromoleculen in de gastheer wordt in deze periode stopgezet, maar de chromatinestructuur in de gastheer blijft intact tot de celdood. Late en zeer late virale genen worden tot expressie gebracht door een RNA-polymerase die door het virus wordt gecodeerd.
Microtubuli, gereorganiseerd tijdens de vroege fase van de infectie, worden gedepolymeriseerd door factoren die tijdens de late fase worden geproduceerd, hetgeen leidt tot celafronding (figuur 6). Evenzo, G-actine, geaccumuleerd in de kern tijdens de vroege fase, polymeriseert tijdens de late fase, gelijktijdig met nucleaire zwelling en verdwijning van zichtbare gastheer nucleaire structuren (figuur 7). Het virogene stroma, de plaats van de virale DNA-synthese, vormt zich in het centrum van de kern en wordt afgewisseld en omgeven door een elektron-lucente zone die de ‘ring-zone’ wordt genoemd, een plaats waar de capsiden worden geassembleerd en vastgebonden tijdens het laden van het genoom. Nucleaire F-actine co-lokaliseert met het belangrijkste AcMNPV-capsideproteïne in de ringzone (Figuur 7).
Figuur 6. AcMNPV-geïnfecteerde Sf21-cellen vertonen verschillende fasen van het cytopathogeen effect (CPE). (a) Niet-geïnfecteerde cellen. Let op de spindelvorm en de aanwezigheid van nucleochromatine structuren. (b) AcMNPV-geïnfecteerde cellen met vroege en late CPE. De cellen zijn afgerond door depolymeriserende microtubuli, de kernen zijn groter en ontdaan van gastheerstructuren, en de virogene stroma (vs) is omgeven door de ringzone (rz). Virogene stroma’s worden dichter naarmate het late stadium van infectie vordert. Polyeders vullen de kern tijdens het zeer late stadium van infectie (p).
Figuur 7. Nucleaire F-actine in AcMNPV-geïnfecteerde cel tijdens late genexpressie. (a) DAPI-kleuring geeft de locatie van de kern aan. (b) Groene fluorescentie geeft aan dat capsid eiwit voornamelijk gelokaliseerd is in de ringzone van de kern. (c) Rhodamine-falloidinekleuring toont aan dat F-actine co-lokaliseert met capside in de ringzone.
Nucleair F-actine is vereist voor BV-productie. In aanwezigheid van F-actineverstorende geneesmiddelen zijn de virale capsiden misvormd en verschijnen ze als lange buisvormige structuren naast het binnenste kernmembraan met niet vaak voorkomende patches van elektronendicht materiaal. Basisplaten en kapstructuren die normaal aanwezig zijn, zijn niet zichtbaar, en er wordt een overmaat aan membraanvormige profielen geproduceerd. De virale DNA-synthese verloopt in de normale snelheid, maar de genomen worden niet verpakt, en het virogene stroma ziet er “ontspannen” uit in vergelijking met normaal stroma. Interessant is dat het fenotype voor de afwezigheid van AcMNPV very late factor-1 (VLF-1) vergelijkbaar is, wat suggereert dat VLF-1 betrokken kan zijn bij het binden van capsiden aan het virogenetische stroma, en dat F-actine een component van het stroma is waaraan capsiden, direct of indirect, zijn gehecht.
P78/83, een minder belangrijk capsideproteïne dat laat tot expressie komt tijdens infectie, is essentieel voor de levensvatbaarheid van AcMNPV. Deze eigenschap werd meer dan 30 jaar geleden opgemerkt en geëxploiteerd in de eerste commerciële baculovirus expressiekits. P78/83 (78 kDa wanneer niet gefosforyleerd en 83 kDa wanneer gefosforyleerd) wordt verondersteld deel uit te maken van de basisplaten van zowel BV- als ODV-capsiden. P78/83 is een F-actine-bindend eiwit, en deze activiteit kan helpen om de capsiden tijdens de assemblage aan de kernmatrix te binden. Interessant is dat P78/83 nog een andere activiteit bevat die verklaart waarom het essentieel is; het bevordert actinepolymerisatie binnen de kern. P78/83 bevat domeinen die geconserveerd zijn in leden van de Wiskott-Aldrich syndroom proteïne (WASP) familie, factoren die de nucleatie van actine filamenten bevorderen. Leden van de WASP-familie reguleren positief de actine-nucleerende activiteit van het Actin Related Protein (Arp)-2/3 complex. Dit complex met zeven subeenheden, dat in alle eukaryoten geconserveerd is, wordt naar de kern getranslokeerd in cellen die met AcMNPV geïnfecteerd zijn en wordt geactiveerd door P78/83. Mutaties in P78/83 die leiden tot een verminderd vermogen om actinekernvorming te bevorderen, leiden dienovereenkomstig tot een verminderd vermogen om infectieuze BV te produceren.
Onmiddellijk na binnenkomst in de celkern neemt AcMNPV DNA een nucleosoom-achtige structuur aan en maakt het gebruik van nucleosomen en nucleosoom-gerelateerde processen bij de genoom-replicatie. Een onderdeel van de virale replicatiestrategie lijkt derhalve te bestaan uit het kapen van componenten van, zo niet de gehele, chromatine-remodelleringscapaciteit van de gastheer. Recente gegevens suggereren dat de BRO (baculovirus repeated orf) familie van eiwitten waarschijnlijk bij dit proces betrokken zijn. De BRO-eiwitten komen vroeg tijdens de infectie tot expressie, binden enkelstrengs DNA (ssDNA) en kernhistonen, en verdelen zich met histonen in fractioneringsexperimenten. BmNPV, orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus, en lymantria dispar multiple nucleopolyhedrovirus hebben allemaal meerdere bro-genen. AcMNPV draagt slechts één bro-gen, verwant aan BmNPV bro-d, dat essentieel is.
AcMNPV-gecodeerd P6.9, het zeer basale genoom verpakkingseiwit, begint te accumuleren tijdens het late stadium van infectie en een alternatieve chromatinestructuur ontstaat.
De P6.9-DNA interacties worden gecontroleerd door de fosforyleringstoestand van P6.9. Tijdens het verpakken van het genoom bindt het genomisch DNA van de virogene stroma zich met P6.9 wanneer P6.9 wordt gedefosforyleerd en condenseert tot een voorgevormde capsidische mantel door een opening in een conische eindstructuur. De conische structuren liggen proximaal aan het virogene stroma met capsidische omhulsels afgedekt door basisplaten die zich distaal uitstrekken in een minder elektronendichte ruimte, de ringzone. F-actine en capsideproteïne co-lokaliseren in de ringzone, samen met P78/83 en het Arp2/3 complex. Het is dit stadium van de replicatie dat zowel door geneesmiddelen die F-actine verstoren als door de afwezigheid van VLF-1 wordt beïnvloed.
Met het begin van de zeer late fase van de infectie is er een vermindering van de BV-productie en is er een begin van ODV-productie. Nieuw geassembleerde nucleocapsiden blijven in de kern waar ze worden omhuld door omhulsels die vermoedelijk afkomstig zijn van het binnenste kernmembraan. Omhulde virionen, maar niet niet-omhulde nucleocapsiden, raken verstopt in een eiwitmatrix en vormen capsules of veelvlakken. De cellen lyseren uiteindelijk, waarbij de occlusies in het medium vrijkomen.