DE PROMISE VAN VERBETERDE THERAPIEËN DOOR MECOLECULAIRE STUDIES VAN FETALE HEMOGLOBINE REGELING
Hoewel de hierboven besproken niet gerichte therapeutische benaderingen een belofte en enig succes hebben getoond bij het induceren van HbF in klinische settings, een beter mechanistisch begrip van de moleculaire grondslagen die nodig zijn voor de normale hemoglobine omschakeling van foetus naar volwassene houdt een grote belofte in voor het ontwikkelen van meer effectieve en specifiek gerichte benaderingen voor HbF inductie. In de decennia die volgden op de moleculaire klonering van de globine genen, werden verschillende transcriptie factoren geïdentificeerd die een rol speelden in de regulatie van het globine gen (Cantor en Orkin 2002). Hiertoe behoorden transcriptiefactoren zoals GATA1, KLF1, en SCL/TAL1. Het bestuderen van de rol van deze factoren in de regulatie van het globine gen werd echter bemoeilijkt door de brede rol van deze factoren in differentiatie en hun pleiotrope rol als regulatoren van globine en erythroïde genregulatie. Geen van deze factoren bleken specifieke regulatoren te zijn van de overgang van foetale naar volwassen hemoglobine. Het duurde bijna drie decennia vanaf de eerste klonering van de globine genen voordat specifieke regulatoren van dit proces zouden worden geïdentificeerd.
Belangrijke aanwijzingen voor de identiteit van dergelijke factoren kwamen voort uit de studie van natuurlijke menselijke genetische variatie. Een aantal groepen zocht naar de basis voor gemeenschappelijke genetische variatie in HbF-niveaus met behulp van zowel gerichte als genoomwijde associatiestudies (GWAS) (Menzel et al. 2007; Thein et al. 2007; Lettre et al. 2008; Uda et al. 2008). Deze studies resulteerden in de identificatie van drie genomische loci die gemeenschappelijke varianten bevatten die de HbF niveaus beïnvloedden. Dit omvatte een regio van chromosoom 2 binnen het BCL11A gen, een regio intergenisch tussen de genen HBS1L en MYB op chromosoom 6, en varianten binnen de β-globine locus op chromosoom 11. Recente studies die deze genetische varianten nauwkeuriger in kaart hebben gebracht, suggereren dat >50% van de variatie in HbF niveaus verklaard kan worden door gemeenschappelijke variatie op deze drie loci (Galarneau et al. 2010). Hoewel HbF niveaus verondersteld worden een erfelijke genetische component te hebben in de orde van ∼80%, is het belangrijk om in gedachten te houden dat de additieve genetische variatie gevonden van gemeenschappelijke genetische varianten potentiële hogere-orde genetische interacties negeert die mogelijk niet worden gedetecteerd en daarom moet de mate waarin HbF niveaus genetisch bepaald zijn nog worden onderzocht in toekomstige studies (Zuk et al. 2012).
De eerste waarneming van varianten geassocieerd met HbF-niveaus binnen de zinkvingertranscriptiefactor BCL11A leidde tot een eerste studie die de hypothese nastreefde dat BCL11A een regulator van HbF-expressie zou kunnen zijn (Sankaran et al. 2008). Eerder werk had gesuggereerd dat BCL11A een kritieke transcriptionele regulator was die betrokken was bij B-lymfopoëse en neurogenese (Sankaran et al. 2010). BCL11A eiwitniveaus bleken te correleren met het ontwikkelingsstadium van expressie, zodat primitieve en foetale lever definitieve erythroïde cellen die hoge niveaus van γ-globine tot expressie brachten, een lage of afwezige expressie hadden van de full-length vormen van BCL11A. Dit resultaat suggereerde dat dit genproduct werkte als een repressor van de γ-globine genen. Om dit rechtstreeks te testen, werd knockdown van BCL11A met behulp van short-hairpin RNA (shRNA) toegepast in primaire volwassen erytroïde progenitors en γ-globine expressie kon robuust geïnduceerd worden bij een dergelijke knockdown. De mate van γ-globine inductie bleek gerelateerd te zijn aan de mate van knockdown van BCL11A. Interessant is dat grote verstoringen in erytropoëse niet leken op te treden ondanks de robuuste γ-globine inductie die gezien werd. Vervolgstudies hebben soortgelijke resultaten aangetoond bij het afbreken van de expressie van BCL11A met shRNA’s (Borg et al. 2010; Zhou et al. 2010; Wilber et al. 2011). Bovendien werd aangetoond dat BCL11A direct interageert met chromatine op de menselijke β-globine locus in primaire erytroïde cellen en dat het leek op te treden als onderdeel van een complex met de transcriptiefactor GATA1 en het NuRD chromatine remodeling en repressor complex (Sankaran et al. 2008). Van belang is dat het NuRD complex de HDACs 1 en 2 bevat, waarvan is gesuggereerd dat zij de kritische HDACs zijn die nodig zijn voor de silencing van HbF (Bradner et al. 2010). Bovendien is gesuggereerd dat de transcriptiefactor SOX6 samenwerkt met BCL11A om de γ-globinegenen bij de mens tot zwijgen te brengen en dat het essentieel kan zijn voor binding van de proximale promotor van deze globinegenen (Xu et al. 2010).
Hoewel hemoglobine-switching in muismodellen, zelfs die met een humaan β-globine locus transgen, lijkt af te wijken van de normale ontogenie van globine-expressie gezien bij de mens, werd een evolutionair geconserveerde rol van BCL11A in globine-gen silencing en switching aangetoond in muizen (Sankaran et al. 2009; McGrath et al. 2011). Muizen die BCL11A missen blijken normale erytropoëse te hebben, maar slagen er niet in om de embryonale globinegenen in definitieve erytroïde cellen volledig stil te leggen en laten enige persistente expressie van γ-globine toe wanneer de intacte humane β-globine locus aanwezig is. Deze bevindingen versterken het belang van BCL11A als een kritieke mediator van globine-switching bij zoogdieren. Hoewel deze eerste studie zich richtte op de rol van BCL11A in het ontwikkelingsproces van globine-switching bij muizen (Sankaran et al. 2009), werd in een recentere studie conditionele inactivatie van BCL11A gebruikt om aan te tonen dat induceerbare inactivatie kan resulteren in robuuste en vergelijkbare mate van γ-globine geninductie als optreedt wanneer inactivatie op eerdere tijdstippen optreedt (Xu et al. 2011). Hoewel de regulatie van de globinegenen bij mensen en muizen verschilt, bleek inactivering van BCL11A voldoende om de hematologische en pathologische kenmerken in muismodellen van sikkelcelziekte te verbeteren, wat een belangrijk bewijs is voor de potentiële werkzaamheid van het richten van BCL11A om HbF te induceren (Xu et al. 2011).
De exacte mechanismen waarmee BCL11A de expressie van het γ-globinegen onderdrukt, blijven onduidelijk. Een recente studie suggereert dat dit kan worden gemedieerd door zowel interacties met transcriptiefactoren, zoals SOX6, die chromatine binden aan de proximale γ-globine promotors, als door lange-afstand interacties met een verscheidenheid van regio’s in de gehele β-globine gencluster (Xu et al. 2010). Wanneer BCL11A afwezig is, verandert de conformatie van de β-globine locus zodanig dat de upstream enhancer, bekend als de locus control regio, naast de transcriptioneel geactiveerde γ-globine genen komt te liggen. Een soortgelijk fenomeen treedt op wanneer cellen worden behandeld met HDAC-remmers die γ-globine genexpressie induceren (Bradner et al. 2010). Het is echter onduidelijk of deze conformatieveranderingen direct gemedieerd worden door BCL11A of dat deze veranderingen secundair optreden aan het HbF-inductieve effect van BCL11A (of HDAC) remming. Desalniettemin ondersteunen deze bevindingen sterk de notie dat BCL11A een directe rol lijkt te spelen in het silencen van γ-globine expressie binnen de β-globine locus. Door het in kaart brengen van verschillende deleties binnen de humane β-globine locus die ofwel resulteren in δβ-thalassemie, met bescheiden toenames in HbF en enige resterende onbalans in de globine keten, of HPFH, met robuuste toenames in HbF en evenwichtige globine keten synthese, werd aangetoond dat een N3-kb regio stroomopwaarts van het δ-globine gen noodzakelijk is voor de silencing van de γ-globine genen (Fig. 2) (Sankaran et al. 2011c). Interessant is dat deze regio bindingsplaatsen herbergt voor BCL11A, samen met zijn partners zoals GATA1 en HDAC1. Deze regio is ook onafhankelijk geïmpliceerd als zijnde belangrijk voor γ-globine silencing door studies van de Corfu thalassemia deletie bij de mens (Chakalova et al. 2005). Deze studie geeft een belangrijk mechanistisch inzicht in hoe BCL11A functioneert om HbF stil te leggen en versterkt het belang van natuurlijke menselijke mutaties voor het begrijpen van dit ontwikkelingsproces dat uniek is voor de mens (Fig. 2) (Sankaran et al. 2011c).
Een model voor de regulatie van γ-globine silencing in de menselijke β-globine locus. Deze illustratie toont de menselijke β-globine locus zoals weergegeven in figuur 1 met een ∼3-kb regio stroomopwaarts van het δ-globine gen dat werd gevonden door de regio’s verwijderd in verschillende hereditaire persistentie van foetale hemoglobine (HPFH) deleties te vergelijken met de regio’s verwijderd door δβ-thalassemie deleties (Sankaran et al. 2011c). Typische deleties worden geïllustreerd in het model onder de locus. Daarnaast is ook van de Corfu-thalassemie deletie bekend dat deze regio wordt verwijderd, zoals weergegeven in het model hieronder. Er is aangetoond dat BCL11A zich binnen deze 3-kb-regio aan chromatine bindt, samen met zijn partners GATA1 en HDAC1 (Sankaran et al. 2011c).
Gezien deze bevindingen zal BCL11A waarschijnlijk een belangrijk therapeutisch doelwit zijn. Het feit dat inactivering ervan HbF induceert zonder dat dit leidt tot een grote verstoring van de erytropoëse is veelbelovend, hoewel bekend is dat het ook belangrijke effecten heeft in andere lineages zoals B-lymfocyten, wat het belang onderstreept van in vivo modellering en analyse als onderdeel van de huidige inspanningen om BCL11A als doelwit te nemen voor HbF-inductie. Verder onderzoek naar de werkingsmechanismen van BCL11A zou kunnen leiden tot betere en meer gerichte benaderingen voor HbF-inductie (Sankaran et al. 2011c). SOX6 is mogelijk ook een veelbelovend doelwit voor HbF-inductie (Xu et al. 2010), hoewel bekend is dat het nodig is voor normale erytropoëse (Dumitriu et al. 2006). Er is echter een patiënt gerapporteerd met een heterozygote verstoring van SOX6 die geen verhoogde HbF-spiegels had, wat suggereert dat het SOX6-gen een mechanisme voor doseringscompensatie zou kunnen hebben of dat er een bepaalde drempel nodig zou kunnen zijn voor het verminderen van de expressie van dit gen om robuuste HbF-inductie te hebben (Sankaran et al. 2011a). Dit suggereert dat er beperkingen kunnen zijn bij het beschouwen van SOX6 als een potentieel doelwit voor HbF-inductie.
Na de eerste studies over BCL11A, suggereerden twee studies dat de expressie van BCL11A lijkt te worden gecontroleerd door de erythroïde-specifieke transcriptiefactor KLF1 met behulp van onafhankelijke en complementaire benaderingen. In één studie resulteerde een muis met een hypomorf allel van KLF1 in verhogingen van de embryonale globine-expressie en transgene muizen met de menselijke β-globine locus vertoonden persistente expressie van γ-globine (Zhou et al. 2010). Bijgevolg testten de onderzoekers of dezelfde regulatie kon optreden in primaire menselijke erytroïde cellen en konden zij een vergelijkbaar verband aantonen met behulp van shRNA-benaderingen. De onderzoekers toonden vervolgens aan dat dit effect optreedt via zowel directe effecten van KLF1 op de β-globine locus, maar ook via indirecte effecten gemedieerd door verminderde expressie van BCL11A bij KLF1 knockdown. Deze bevinding toonde aan dat KLF1 een directe positieve transcriptionele regulator van BCL11A expressie was. Een tweede groep onderzocht de genetische basis van een niet-gelinkte vorm van HPFH waarvan werd gesuggereerd dat die het gevolg was van een KLF1 missense mutatie in deze familie (Borg et al. 2010). De onderzoekers konden met primaire cellen van deze patiënten en van niet-aangedane controles aantonen dat het waargenomen effect gedeeltelijk toe te schrijven was aan een silencing effect van KLF1 op BCL11A. Eén gebied waarover nog onzekerheid bestaat, betreft de menselijke fenotypes die worden waargenomen bij verschillende gevallen van KLF1-mutaties. Hoewel in het eerste rapport alle ontvangers van de missense mutatie verhogingen in HbF expressie hadden, moet worden opgemerkt dat dit in feite varieerde tussen 3% en 19% van het totale hemoglobinegehalte. Bovendien laten andere rapporten van heterozygote KLF1-mutaties bij mensen ofwel een gelijktijdige verstoring van de erytropoëse zien, ofwel weinig effect op de HbF-expressie (Arnaud et al. 2010; Satta et al. 2011). Recentere studies suggereren dat zeldzame varianten in KLF1 inderdaad geassocieerd zijn met verhogingen in HbF, maar dit lijkt niet consistent of in dezelfde mate voor te komen, zelfs niet bij vergelijkbare mutaties (Gallienne et al. 2012). De basis van deze variatie moet nog bepaald worden en het zal belangrijk zijn om de mechanismen beter te begrijpen waarmee KLF1 zowel direct als indirect de expressie van HbF beïnvloedt. Dit zal van cruciaal belang zijn voor toekomstige pogingen om KLF1 als doelwit te nemen voor de inductie van HbF, vooral als de ongewenste effecten van een dergelijke remming op de erythroïde differentiatie vermeden moeten worden. Echter, gezien de specificiteit van KLF1 binnen de erytroïde lineage en als de globine-gen regulerende activiteit van KLF1 specifiek kan worden gericht, moet het nog steeds worden beschouwd als een kandidaat voor het induceren van HbF.
Naast de gemeenschappelijke genetische varianten die in BCL11A zijn geïdentificeerd en die geassocieerd zijn met HbF niveaus bij de mens, toonden de GWAS studies aan dat er varianten waren op chromosoom 6 intergenic tussen de genen HBS1L en MYB die een dramatisch effect lijken te hebben op HbF niveaus bij de mens (Menzel et al. 2007; Thein et al. 2007; Lettre et al. 2008; Uda et al. 2008). Inzicht in het werkingsmechanisme waardoor deze varianten resulteren in veranderingen in HbF niveaus is belangrijk, omdat de genetische varianten op deze locus een even groot of misschien zelfs een groter effect lijken te hebben op de klinische morbiditeit in de β-hemoglobinopathieën als de varianten op de BCL11A locus (Galanello et al. 2009; Nuinoon et al. 2010). Interessant is dat deze regio een verscheidenheid aan regulerende elementen bevat waarvan is gesuggereerd dat ze een belangrijke rol spelen bij het reguleren van de expressie van MYB in erythroïde progenitors (Mukai et al. 2006; Wahlberg et al. 2009; Stadhouders et al. 2011). Hoewel overexpressie van HBS1L geen effect leek te hebben op de expressie van γ-globine in K562 erytroleukemiecellen, bleek overexpressie van MYB wel invloed te hebben op het niveau van γ-globine dat in deze cellen werd geproduceerd (Jiang et al. 2006). Bovendien hadden kweken van primaire erythroïde progenitors van mensen met een hogere expressie van HbF vaker een verlaagde expressie van MYB (Jiang et al. 2006).
In vervolg op de klassieke klinische observatie dat patiënten met een trisomie van chromosoom 13 een vertraagde foetale-naar-volwassen hemoglobine-switch hebben en persistente expressie van HbF blijven hebben (Huehns et al. 1964; Sankaran en Sapp 2012), hebben recente studies verder bewijs geleverd voor een rol van MYB in het reguleren van HbF-expressie. Door genen in een regio op chromosoom 13 die noodzakelijk wordt geacht voor de verhoging van HbF bij patiënten met partiële trisomieën van chromosoom 13 fijn in kaart te brengen en een integratieve genomische analyse uit te voeren, werd ontdekt dat er twee kleine ∼22 nucleotide RNA-moleculen zijn die topkandidaten zijn om een dergelijke activiteit uit te voeren, microRNA’s 15a en 16-1 (Sankaran et al. 2011b). Overexpressie van deze microRNA’s in primaire volwassen erytroïde cellen in cultuur resulteerde in een toename van de γ-globine productie. Door de doelwitten van deze microRNA’s te onderzoeken, werd vastgesteld dat een belangrijk doelwit in erytroïde cellen MYB was. Directe uitschakeling van MYB in primaire volwassen erytroïde progenitors resulteerde in een dramatische toename van de γ-globine productie (Sankaran et al. 2011b), waardoor deze historische waarneming van een zeldzaam humaan aneuploïdiesyndroom wordt gekoppeld aan het meer recente onderzoek naar moleculaire mechanismen die het HbF-niveau reguleren.
Het mechanisme waarmee MYB het HbF-niveau kan reguleren blijft onduidelijk. Dit kan het gevolg zijn van een effect op de kinetiek van erytropoëse of kan ook optreden als gevolg van een direct effect binnen de β-globine locus (Higgs and Wood 2008). Dergelijke mechanismen moeten verder worden onderzocht en zijn veelbelovend voor pogingen om deze molecule therapeutisch te richten voor HbF-inductie. Er bestaat bezorgdheid dat gericht gebruik van MYB ongewenste neveneffecten kan hebben, vooral gezien de pleiotrope rol van MYB in de hematopoëse (Emambokus et al. 2003; Carpinelli et al. 2004). Recent werk suggereert echter dat dergelijke strategieën veelbelovend kunnen zijn, omdat gedeeltelijke uitschakeling van Myb in muizen weinig effect had op normale in vivo hematopoëse, terwijl de progressie van leukemieën drastisch werd geblokkeerd (Zuber et al. 2011a). Daarom kan gedeeltelijke remming van MYB een waardevolle strategie zijn voor HbF inductie. De additiviteit van de effecten van varianten in de HBS1L-MYB intergenische regio samen met varianten op de BCL11A locus (Lettre et al. 2008; Galanello et al. 2009; Nuinoon et al. 2010) suggereert dat het aanpakken van deze beide pathways samen nog robuustere effecten zou kunnen opleveren dan het aanpakken van een van beide pathways alleen.
Hoewel de hierboven besproken regulatoren van HbF-regulatie zijn gevonden door middel van humane genetische studies, waardoor hun in vivo relevantie bij de mens wordt bevestigd, is ook gesuggereerd dat een verscheidenheid aan andere moleculen een rol spelen bij de regulatie van het γ-globinegen door middel van verschillende studies met behulp van celcultuurbenaderingen of met muismodellen (tabel 1). Deze moleculen zullen hieronder worden besproken. Het is belangrijk in gedachten te houden dat er beperkingen zijn voor de meeste van de thans beschikbare experimentele systemen die worden gebruikt om de regulatie van het γ-globine gen te bestuderen. Primaire menselijke erythroïde cellen lijken tolerant te zijn voor manipulatie die een toename van de γ-globine productie mogelijk maakt, wat niet altijd relevant is bij de mens in vivo. Bovendien zijn veel van de stimuli waarvan bekend is dat ze in vivo γ-globine productie induceren bij de mens, waaronder verschillende vormen van stress erytropoëse en behandeling met hydroxyureum, niet werkzaam om γ-globine productie te induceren in gehumaniseerde muismodellen (Pace et al. 1994; Sankaran et al. 2009), wat een belangrijke beperking is voor het interpreteren van negatieve bevindingen in dit experimentele systeem. Voorzichtigheid is dus geboden bij het interpreteren van experimentele bevindingen die niet worden ondersteund door bewijs uit menselijke genetische studies of studies uitgevoerd bij mensen of primaten in vivo.
Tabel 1.
Een gedeeltelijke lijst van foetale hemoglobine regulatoren
| Regulator | Richting van modulatie nodig om HbF te verhogen | Menselijk genetisch bewijs dat rol in HbF-regulatie ondersteunt | Menselijke of primatenstudies naar modulerende factor betrokken bij HbF-regulatie | Celcultuurgegevens die rol in HbF-regulatie ondersteunen | Evidentie van muismodellen die een rol in HbF-regulatie suggereren |
|---|---|---|---|---|---|
| BCL11A | ↓ | × | × | ||
| KLF1 | ↓ | × | × | × | |
| MYB | ↓ | × | × | × | |
| MicroRNAs 15a/16-1 | × | × | |||
| SOX6 | ↓ | × | |||
| HDACs 1/ 2 | ↓ | × | × | × | |
| DNMT1 | ↓ | × | × | × | |
| TR2/TR4 | ↓ of | × | × | ||
| COUP-TFII | ↓ | × | |||
| FOP | ↓ | × | |||
| NF-E4 | × |
Door eiwitten te onderzoeken die zich binden aan de directe herhalingselementen in de promotor van de γ-globine genen, is gesuggereerd dat de wees-nucleaire hormoonreceptoren TR2 en TR4 een rol spelen als onderdrukkers van de expressie van de γ-globinegenen (Tanabe et al. 2002, 2007; Cui et al. 2011). Paradoxaal genoeg resulteert overexpressie van TR2 en TR4 in transgene muismodellen in verhoogde expressie van γ-globine en wanneer overgeëxpresseerd in muizenmodellen voor sikkelcelziekte kan dit resulteren in gedeeltelijke verbetering van de hematologische en pathologische symptomen van deze muizen (Campbell et al. 2011). De mechanismen die aan deze waarnemingen ten grondslag liggen en de relevantie voor de regulatie van het menselijke globinegen moeten nog worden vastgesteld voor TR2 en TR4. Bovendien is ook gesuggereerd dat het wees-nucleaire hormoon nucleaire receptor COUP-TFII zich bindt aan de directe herhalingen en de γ-globine promotor bij de mens onderdrukt (Filipe et al. 1999). Met behulp van in vitro culturen van primaire volwassen erytroïde cellen werd aangetoond dat cytokinen zoals SCF de expressie en chromatinebezetting van COUP-TFII op de β-globine locus blijken te down-reguleren, wat resulteert in verhoogde γ-globine expressie (Aerbajinai et al. 2009). Bovendien zou directe down-regulatie van COUP-TFII met behulp van kleine interfererende RNA’s (siRNA’s) kunnen resulteren in een toename van de γ-globine productie (Aerbajinai et al. 2009). Verdere studies naar de rol van COUP-TFs in de regulatie van HbF zijn nodig om de fysiologische rol bij de mens beter te begrijpen.
Recente studies hebben ook een rol gesuggereerd voor het gen genaamd friend of PRMT1 (FOP1) in de onderdrukking van γ-globine genexpressie (van Dijk et al. 2010). Knockdown van FOP1 resulteert in verhoogde HbF expressie in humane volwassen erythroïde cellen in cultuur. Er werd gesuggereerd dat dit werd gemedieerd door verminderde expressie van SOX6, waarvan bekend is dat knockdown ook leidt tot verhoogde γ-globine productie (Xu et al. 2010). Verder werk zal nodig zijn om deze bevindingen te bevestigen, te begrijpen of dit gen ook een rol speelt in erytropoëse in het algemeen, en het mechanisme te onderzoeken dat aan deze waarnemingen ten grondslag ligt.
Enkele studies hebben ook een rol gesuggereerd voor het stadium-selector eiwit NF-E4 als een activator van γ-globine expressie bij de mens (Jane et al. 1995; Zhao et al. 2006). Er is gesuggereerd dat een korte vorm van NF-E4 een rol kan spelen in de repressie van de γ-globine genen door de normale activerende functie van NF-E4 bij de promotor van deze genen te remmen (Zhou et al. 2004). Al deze studies zijn gebaseerd op experimenten in gekweekte cellen en biochemische zuivering van eiwitcomplexen uit K562 cellen en daarom zal verder werk nodig zijn om de fysiologische rol van dit gen in de expressie van γ-globine te bevestigen en de mechanismen beter te begrijpen waardoor dit complex de regulatie van het humane globinegen zou kunnen veranderen.